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日本乙型脑炎(Janpanese encephalitis,JE)简称乙脑,是由日本乙型脑炎病毒(Janpanese encephalitis virus,JEV)引起的一种严重的人畜共患虫媒性病毒病,人感染后能够引起20％～50%的致死率。同时,乙脑也严重危害养猪业,给养猪业造成巨大的经济损失。对于乙脑有效预防和控制的关键是发展安全、有效的疫苗。
在表达PrM/E基因的真核细胞中,PrM蛋白和E蛋白分泌到细胞外后能自发形成病毒样颗粒(VLPs)。利用这一特性,可以用哺乳动物细胞体外共表达PrM/E形成病毒样颗粒。用复制子系统转染表达JEV结构蛋白的细胞系时能够获得具有“一过性感染”能力的安全高效的病毒样颗粒。这种VLPs与真实的病毒颗粒具有相同的免疫原性和抗原性,可以为今后开发研究乙脑新型疫苗和诊断抗原提供新的思路。
本研究采用Tet-on advance系统来调控表达乙脑病毒PrM/E基因,避免PrM和E蛋白在细胞内共表达引起较高的细胞毒性而导致无法建系的缺点。利用RT-PCR方法扩增JEVPrM/E基因,将其克隆到Tet-on advance系统反应质粒pTRE-Tight中。将构建好的重组质粒pTRE-Tight-JME转染Hela Tet-on advanced细胞,经HygB(潮霉素B)筛选20天,挑取细胞,进行RT-PCR、IFA、Western blot鉴定,最终获得了2株稳定表达乙脑病毒PrM/E蛋白的细胞系,命名为J32＃24-1、J32＃24-3。
建立稳定表达乙脑病毒PrM/E蛋白的细胞系,是获得病毒样颗粒的重要环节,并且利于获得大量的高滴度的病毒样颗粒。本研究将细胞系J32＃24-1用Dox诱导后,收获含病毒样颗粒的细胞上清,电镜观察,可以看到直径约30nm的粒子。激光共聚焦对E蛋白定位,发现E蛋白主要在内质网富集。细胞系J32＃24-1转染复制子载体pJEV-REP-GFP后,可以包装出“一过性感染”的病毒样颗粒,在电镜下也可以看到约30nm的粒子。将病毒样颗粒感染BHK-21细胞后,经RT-PCR、IFA可以检测到非结构蛋白的转录和表达,证明其“一过性感染”的特性,滴度为6×106UI/mL。将滴度为6×106UI/mL的“一过性感染”VLPs和常规VLPs免疫小鼠后,用间接ELISA方法可以检测到特异性抗体,与商品化弱毒疫苗的抗体水平相当,二免后血清中和抗体滴度为1:128。免疫28天后用100TCID50的乙脑病毒BJB株进行攻毒保护试验,免疫“一过性感染”VLPs和常规VLPs组小鼠均有85%的保护率,商品化弱毒疫苗的保护率为100%。实验结果表明JEV病毒样颗粒安全高效。