细胞凋亡是多细胞组织中的一种程序性死亡。它的主要功能是清除机体内损坏或过多的细胞,从而有助于机体的存活。Caspase,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cycteinylaspartate specific protease,Caspase）是细胞凋亡途径中的关键酶。Caspase参与多种类型的神经细胞凋亡,其中包括β淀粉样肽诱导的细胞死亡。但是其具体作用机制还有争议。 Caspase-2是Caspase家族中的一个特殊成员,具有类似于启始Caspases与效应Caspases的结构与功能特征。Caspase-2参与神经细胞凋亡过程,但是其功能及参与的信号通路还值得进一步研究。 本文利用过量表达Caspase-2的神经瘤母细胞SH-Sy5Y研究了在神经细胞凋亡中Caspase-2的作用,以及Caspase-2过表达对β淀粉样肽诱导的神经细胞凋亡的影响。 1.Caspase-2基因诱导SH-Sy5Y细胞凋亡 本文采用PCR技术从大鼠的大脑中克隆出Caspase-2全长cDNA,然后克隆入载体pcDNA3.1（+）,构建pcDNA3.1/Caspase-2真核表达载体。将pcDNA3.1/Caspase-2载体转染入SH-Sy5Y细胞。使Caspase-2在SH-Sy5Y细胞中过量表达。实时荧光定量PCR检测Caspase-2和Caspase-3的基因表达水平、蛋白酶活力检测法检测Caspase-2和Caspase-3的活力。Hochest33342染色及Annexin v-biotin检测细胞调亡。结果显示,Caspase-2基因过表达可诱导SH-Sy5Y细胞凋亡,同时Caspase-3 mRNA表达及蛋白酶活力水平上升。 2.β-淀粉样蛋白诱导SH—Sy5Y细胞凋亡 用不同浓度的Aβ₄₂处理SH-Sy5Y细胞24h,MTT法检测细胞的活力;Hochest33342染色法及Annexin v-biotin早期凋亡检测方法检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR检测Caspase-2表达水平;蛋白酶活力检测法检测Caspase-3蛋白酶活力。结果显示,Aβ₄₂能够使细胞活力显著下降,并诱导SH—Sy5Y细胞凋亡;同时Caspase-2 mRNA表达水平显著升高,而Caspase-3蛋白酶活力显著下降。 3.Caspase-2过表达对Aβ₄₂诱导的神经细胞凋亡的影响 本实验在SH-Sy5Y细胞中过表达Caspase-2,考察其对Aβ₄₂诱导的神经细胞凋亡的影响。用Aβ₄₂处理已经过量表达Caspase-2的SH-Sy5Y细胞,Annexin v-biotin早期凋亡检测方法检测细胞凋亡:实时荧光定量PCR检测Caspase-2表