第一部分:广西HIV-1耐药性流行情况及其关联因素研究目的:调查广西HIV-1耐药性流行情况,并探讨可能与耐药性突变有关联的因素。方法:在广西柳州、南宁两市对304名HIV感染者/AIDS患者进行问卷调查,收集可能与HIV-1耐药性有关联的资料,并采集研究对象外周静脉血,提取病毒RNA,用巢式逆转录聚合酶链反应(nested RT-PCR)扩增编码病毒蛋白酶1～99位氨基酸和逆转录酶1～285位氨基酸的核酸序列,通过测序获得DNA序列。将序列提交到斯坦福大学HIV耐药性数据库,获得耐药性突变位点及耐药水平有关信息。应用MEGA 4软件构建系统进化树,分析样本序列的亚型。将已接受抗病毒治疗的患者按不同特征分组,用卡方检验或Fisher确切概率法比较不同对比组的耐药率,分析研究对象特征与耐药性的关联性。结果:获得219份DNA序列,其中86份来自接受抗病毒治疗的患者,133份来自未治疗者。经系统进化树分析,鉴定出218份样本的亚型,包括CRF01_AE 176份,CRF07_BC 26份,CRF08_BC 13份,B亚型2份,C亚型1份。蛋白酶抑制剂(PIs)、核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)相关突变的发生率分别为6.9%(14/219)、30.14%(66/219)和14.16%(31/219)。CRF07_BC发生PIs相关突变的频率高于CRF01_AE,CRF08_BC发生NRTIs相关突变的频率高于CRF01_AE和CRF07_BC。PIs次要突变A71V/T主要出现于CRF07_BC,NRTIs次要突变T69S主要出现于CRF08_BC。在219例患者中,至少对1种药物低度以上耐药者18例,总耐药率8.22%(18/219),其中治疗患者耐药率为17.44%(15/86),未治疗者耐药率为2.26%(3/133)。在已经产生耐药的患者中,对NRTIs和NNRTIs的高度耐药分别占77.78%和72.22%,交叉耐药的比例均高达100%,二重耐药的比例也达77.78%。耐药与治疗时间,服药依从性和职业有关,与性别、年龄、文化程度、民族、病毒亚型、传播途径、治疗方案等因素无关。治疗1～2年与治疗时间≥2年耐药率的差异无显著性意义,而治疗时间1年以上者,耐药率高于治疗<1年者(OR=8.089,P<0.030)。服药依从性为50～90%的患者,耐药率高于服药依从性≥90%者(OR=8.591,P=0.030);农民患者的耐药率高于其它职业和无业人员(OR=4.223,P=0.017);农民患者服药依从性低于其它职业和无业人员(P=0.007)。结论:广西HIV-1耐药率处于较低的水平,但是对NRTIs和NNRTIs耐药的患者多为高中度耐药、交叉耐药和二重耐药。抗病毒治疗时间、服药依从性和职业因素与耐药有关,抗病毒治疗1年以上、服药依从性低于90%、职业为农民,耐药率相对较高。农民耐药率较高可能与服药依从性较低有关,提供方便的取药渠道,加强教育以提高农民患者服药依从性可能有助于降低农民的耐药率。感染不同亚型的患者耐药率没有差异,但是不同亚型耐药模式有所不同,A71V/T主要出现于CRF07_BC,而T69S主要出现于CRF08_BC。第二部分:CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC主要耐药性突变的基因屏障研究目的:通过计算CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC发生PIs、NRTIs和NNRTIs主要耐药性突变的基因屏障,从理论上比较不同亚型发生特定耐药性突变的可能性大小,分析不同亚型的耐药模式是否有差异。方法:从本研究第1部分获得pol区DNA序列中,选取全部未治疗患者的序列133株,经过质量筛选和基因重组分析,保留测序质量好、重组断点与参考序列比较无显著偏移的序列,检查密码子简并性,只保留少于2个简并碱基的密码子。通过查询斯坦福大学的HIV drug resistance database数据库,确定PIs主要耐药性突变21个、NRTIs主要耐药性突变16个和NNRTIs主要耐药性突变18个,对照密码子表确定耐药性密码子及其对应的野生型密码子种类。统计每个野生型密码子突变为耐药密码子所需的碱基转换和颠换的数量,根据碱基转换(ts)和基因颠换(tv)发生概率之比约为2.5: 1的规律,将每个碱基转换赋值为1,颠换赋值为2.5,计算每个突变位点所有赋值之和,即为某个序列发生该耐药性突变的基因屏障值。用Kruskal-Wallis test法比较3种不同亚型发生某耐药性突变的基因屏障均值,当差异有显著性意义时,用Nemenyi法进行两两比较。结果:蛋白酶编码区的大多数野生型密码子呈高度保守,只有L10和N88的野生型密码子在3种亚型间有较大差异,但是由于发生L10V/I和N88D/S突变时所需的碱基替换种类和数量均相同,因而3种亚型的基因屏障没有差异(P=1.000)。NRTIs相关突变位点T/S69、K70、L74、V75、V118、L210、T215和K219的野生型密码子使用存在程度不同的偏性,其中T/S69、V118和L210的偏性可对基因屏障产生影响,不同亚型T/S69D、V118I和L210W基因屏障的差异有显著性意义(P<0.001),其中,CRF01_AE和CRF07_BC发生T/S69D突变的基因屏障均高于CRF08_BC(P<0.01),而发生V118I和L210W的基因屏障均低于CRF08_BC(P<0.01)。在NNRTIs相关突变中,K103、V106、V108和V/I179的野生型密码子变异较大,其中V106M和V/I179F突变的基因屏障存在差异,经检验,只有V106M的差异有显著性意义(P<0.001),CRF07_BC发生V106M突变的基因屏障低于CRF01_AE和CRF08_BC(P<0.01),而CRF01_AE与CRF08_BC之间的差异无显著性意义。结论:3种亚型发生大部分主要耐药性突变的基因屏障没有差异,只有L210W、V118I、V106M和T/S69D有差异,提示了在相同的药物选择压力下,CRF01_AE和CRF07_BC比CRF08_BC更容易发生V118I和L210W突变;而CRF08_BC比CRF01_AE和CRF07_BC更容易发生T/S69D突变;CRF07_BC比CRF08_BC和CRF01_AE更容易发生V106M突变;相对于CRF08_BC,CRF07_BC发生V118I、L210W和V106M突变均比较容易。第三部分:广西HIV-1主要流行株亚型快速鉴定方法的建立目的:建立一种简便快捷的多重巢式PCR方法,用于鉴定CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B和C亚型毒株。方法:根据多重巢式PCR原理,针对HIV-1的gag基因区设计亚型特异性引物作内侧引物,以HIV-1 M组通用引物Gag F2/Gag e2作外侧引物。抽取已知HIV-1亚型的阳性样本58份,未知亚型的HIV阳性样本14份,另取已知为CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B、C亚型的样本各1份作阳性对照,以HIV阴性样本10份作阴性对照。从全血中提取人基因组DNA,用外侧引物进行第1轮PCR扩增待测样本DNA,然后以第1轮PCR产物为模板,用CRF01_AE、CRF_BC、B和C亚型特异性引物在同一反应体系中进行第2轮第1次PCR,扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳,根据各亚型目的条带大小来判断亚型。当判断结果为CRF_BC时,以第1轮PCR产物为模板,用另1套专用于鉴别CRF07_BC和CRF08_BC的引物进行第2轮第2次PCR,扩增产物进行2.5%琼脂糖凝胶电泳,根据目的条带的位置来鉴别CRF07_BC和CRF08_BC。为了验证鉴定结果的可靠性,用HIV-1 M组通用引物306/Cn-gag扩增第1轮PCR产物,回收约670bp的目的片段,通过基因测序和系统进化树分析以确定样本的亚型。分别计算两种方法的灵敏度,并以基因测序法为参照,计算多重巢式PCR法的特异度。然后从72份待测样本中,随机抽取CRF01_AE和CRF07_BC样本各10份,CRF08_BC样本5份,按相同的反应体系与反应条件重复实验3次,计算检测结果的重复性。结果:多重巢式PCR能扩增72份待测样本中的66份,包括CRF01_AE 40份,CRF07_BC 14份,CRF08_BC 7份,B亚型5份。10份HIV阴性对照样本均无扩增。306/Cn-gag同样能扩增66份样本,通过基因测序获得64份样本的DNA序列,其余2份样本测序失败,系统进化树分析鉴定出CRF01_AE 39份,CRF07_BC 14份,CRF08_BC 6份,B亚型5份。多重巢式PCR法的灵敏度为91.7%(66/72),基因测序法的灵敏度为88.9%(64/72),经Fisher确切概率法检验,两种方法灵敏度的差异无显著性意义(P=0.492)。多重巢式PCR法与基因测序法对64份样本的鉴定结果完全一致,据此计算出多重巢式PCR法的特异度为100%。3次重复检测均能正确鉴定出CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC的全部样本,因此3种亚型鉴定结果的重复性均为100%。结论:本研究建立的多重巢式PCR法可准确鉴定CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和B亚型毒株。该法具有较高的灵敏度、特异度和重复性,操作简便快速、费用低,适用于广西以及周边地区对HIV-1毒株进行亚型鉴定。