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结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,筛选和鉴定新的结直肠癌诊断和治疗的标志物并解析其机制对结直肠癌的精准诊断和治疗具有重要意义。ETV4是我们前期筛选发现的一个重要的与结直肠癌发生发展密切相关的候选癌基因。我们的前期研究已证实,ETV4在结直肠癌中高表达,且其表达水平与结直肠癌的预后、分级以及淋巴结转移相关,体外和在体内动物实验也已证实ETV4可以明显促进结直肠癌细胞的增殖和转移,同时也发现LOXL2可能是ETV4的一个潜在的重要靶基因。本论文则在此基础上进一步探索ETV4对LOXL2的转录调控效应及其在促进结直肠癌细胞的增殖和迁移中的作用。现将主要发现简述如下。(1)LOXL2在结直肠癌中高表达且与ETV4表达高度正相关首先,我们分析了ETV4在结直肠癌中的表达情况。TCGA数据库分析结果显示,与正常结直肠组织相比,LOXL2在结直肠癌中也是高表达的。采用定量RT-PCR技术进一步验证,结果表明,与癌旁正常组织相比,结直肠癌组织中LOXL2的表达显著上调。TCGA数据库分析结果还表明,LOXL2表达量高的病人组的总体生存时间低于LOXL2低表达组,LOXL2高表达组无病生存时间也明显低于LOXL2低表达组。我们进一步分析了LOXL2和ETV4的表达相关性。TCGA数据库分析结果显示,ETV4与LOXL2在结直肠癌组织中的表达呈显著正相关。定量RT-PCR验证结果同样显示,ETV4与LOXL2在结直肠癌组织中的表达呈显著正相关。该结果提示,ETV4作为一个转录因子可能调控LOXL2的表达。(2)ETV4直接激活LOXL2转录为了进一步分析ETV4是否调控LOXL2的表达,我们采用结直肠癌细胞系HCT116分别构建了相应的ETV4稳定过表达细胞株(ETV4)及其对照细胞株(Empty)、稳定敲减细胞株(ETV4sh)及其对照细胞株(NCsh)。定量RT-PCR和Western Blot分析结果表明,ETV4过表达可导致LOXL2 m RNA和蛋白表达水平上调,而ETV4敲减则导致LOXL2 m RNA和蛋白表达水平下调。该结果提示,ETV4可能促进内源LOXL2的转录。我们进一步分析了ETV4是否直接调控LOXL2的转录。转录因子结合位点分析结果表明,LOXL2启动子区域具有多个ETV4结合位点。我们采用PCR介导的克隆技术构建了多个长度不同的LOXL2基因启动子的荧光素酶报告基因重组质粒以及ETV4结合位点的突变体。双荧光素酶报告基因检测结果表明,ETV4过表达可显著增强含有ETV4结合位点的LOXL2启动子的活性,但对ETV4结合位点定点突变的突变体则无激活作用。Ch IP实验结果表明,ETV4能直接结合至LOXL2的启动子区域。该部分结果表明,ETV4直接激活LOXL2的转录,LOXL2是一个新的ETV4靶基因。(3)LOXL2敲减可抑制ETV4对细胞增殖、迁移和EMT的促进作用为了进一步分析LOXL2在介导ETV4促进结直肠癌细胞增殖、迁移和EMT中的作用,我们采用RNA干扰技术,在HCT116的ETV4稳定过表达细胞株(ETV4)中敲减内源LOXL2的表达,分别设置4组,即Empty组、ETV4组、ETV4+si NC组和ETV4+si LOXL2组。细胞增殖实验和克隆形成实验分析结果表明,LOXL2敲减可导致ETV4促进细胞增殖和促进克隆形成能力显著降低。划痕愈合实验、Transwell侵袭与转移实验检测结果表明,LOXL2敲减同样可导致ETV4促进结直肠癌细胞迁移和侵袭能力显著降低。Western Blot和间接免疫荧光实验结果表明,LOXL2敲减可抑制ETV4导致的EMT标志物E-cadherin下调和Vimentin上调。该部分结果提示,LOXL2作为ETV4的一个靶基因,介导ETV4对细胞增殖、迁移和EMT的促进作用。(4)LOXL2过表达可挽救ETV4的敲减效应为了进一步佐证确认上述结果,我们又分别采用结直肠癌细胞系HCT116和RKO分别构建了相应的ETV4稳定敲减细胞株(ETV4sh)及其对照细胞株(NCsh),并在ETV4sh稳定细胞株中进一步转染LOXL2过表达质粒。细胞增殖实验和划痕愈合实验结果表明,LOXL2过表达可挽救ETV4敲减所导致的细胞增殖抑制和细胞迁移抑制。Western Blot结果表明,LOXL2过表达同样可挽救ETV4敲减所导致的EMT标志物E-cadherin上调和Vimentin下调。该部分结果再次表明,LOXL2作为ETV4的一个靶基因,介导ETV4对细胞增殖、迁移和EMT的促进作用。(5)LOXL2与ETV4结合并促进ETV4对下游靶基因的转录激活鉴于LOXL2与ETV4均主要定位于核内。我们采用分子对接(molecular docking)方法分析发现,ETV4与LOXL2之间可能存在相互作用。免疫共沉淀分析结果表明,ETV4与LOXL2在细胞内相互结合。定量RT-PCR分析结果显示,敲减LOXL2可降低ETV4对其下游靶基因(如NID1和PDGFRB)的转录上调效应。该结果提示,LOXL2与ETV4的结合可促进或有助于ETV4对下游靶基因的转录激活。综上,本研究发现,LOXL2是一个新的ETV4靶基因,ETV4可直接激活LOXL2的转录,LOXL2进一步与ETV4结合并促进或有助于ETV4对下游靶基因的转录激活,从而介导ETV4促进结直肠癌细胞增殖、迁移和EMT的效应。本研究进一步拓展了我们对于ETV4生物学功能及其促进结直肠癌发生发展的认识,为探讨基于ETV4和LOXL2为靶点的结直肠癌诊断与治疗提供了新的视角和实验依据。