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生物芯片是一种高通量的工具,可以一次性对大量序列进行检测和基因分析,能解决传统的核酸印迹杂交操作复杂、成本高、效率低等缺点。
人类基因组计划推动了DNA测序技术的发展,合成测序是其中一种有发展潜力和应用前景的测序方法。基因芯片与合成测序相结合,可以降低测序成本,并实现快速以及高通量的测序。目前新一代测序技术还主要存在两方面的问题:(1)基因组测序模板制备是以PCR(polymerase chain reaction)为基础,这种模板制备方法存在扩增的偏性;(2)测序中核酸的读出采用荧光标记核苷酸的延伸,在每步延伸后需要切除荧光以避免荧光的累积。但切除步骤较为复杂,成本高、耗时长,并直接影响测序长度。针对上述两个问题,本研究提出两种解决方案:(1)以滚环扩增为基础制备模板;(2)用淬灭剂直接对测序中的荧光进行淬灭。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传学修饰,DNA的异常甲基化是导致癌症发生的重要原因。DNA甲基化的检测方法是DNA甲基化研究的基础,缺少高通量,高灵敏度的检测技术是阻碍在基因组水平上研究DNA甲基化功能的关键原因。本研究基于亚硫酸氢盐测序方法,提出了2种在芯片上进行滚环扩增制备分子克隆,通过芯片杂交无PCR扩增偏性高灵敏度检测DNA甲基化的方法。
1.以DABCYL为荧光淬灭剂的DNA测序研究
荧光淬灭剂DABCYL能够吸收荧光素等分子的激发能,通过能量转移实现荧光淬灭。本论文提出了一种通过DABCYL淬灭核苷酸上荧光的合成测序方法,并对荧光淬灭的条件进行了优化。研究发现,对醛基修饰的玻片用0.1 mol/1的DABCYL在40℃时进行5分钟处理,对于4种常用于核酸标记的荧光(FITC、Cy3、Cy5和TAMAR)的淬灭效率都在99%以上;荧光焠灭后再延伸效率在90%以上。荧光光谱研究发现在上述4种荧光基团中DABCYL对于Cy5的淬灭效率最低。实验表明,采用以DABCYL为荧光焠灭剂的测序方法可测出17个碱基。
2.以过氧化氢为淬灭剂对基于单引物滚环扩增DNA测序模板的测序研究
本研究提出了一种以滚环扩增(Rolling Circle Amplication,RCA)为基础的测序模板制备方法。通过比较丙烯酰胺修饰的玻片、链亲和素修饰的玻片以及醛基修饰的玻片,结果表明丙烯酰胺修饰的玻片对滚环扩增产物有较高的固定效率,在玻片上固定滚环扩增产物能够进行在片延伸。过氧化氢作为一种较强的氧化剂,能破坏荧光素的分子结构,从而淬灭荧光。应用过氧化氢作为荧光淬灭剂淬灭测序中的核酸分子标记的荧光。用30%H2O2在30℃处理5分钟,对于Cy5的淬灭效率为67%左右。过氧化氢处理后核酸的再延伸效率达到80%。荧光光谱研究发现DABCYL对4种荧光(FITC、Cy3、Cy5和TAMAR)基团的淬灭效率从低到高的次序为Cy3>TAMAR>Cy5>FITC。实验表明,对于滚环扩增制备的测序模板采用过氧化氢作为淬灭剂能够测出27个碱基。
3.以硫酸铜为淬灭剂对基于超分支滚环扩增制备的DNA测序模板的测序研究
为进一步提高滚环扩增产物的模板量,提出了在芯片上以超分支滚环扩增(Hyper-branched Rolling Circle Amplication,HRCA)为基础制备DNA测序模板的方法。用丙烯酰胺修饰的玻片固定双引物扩增的滚环产物。实验表明,双引物滚环扩增比单引物滚环扩增的产物多,并且HRCA产物制备的测序模板能够进行在片延伸。应用硫酸铜作为荧光淬灭剂淬灭测序中的荧光,并对淬灭反应的温度、浓度、时间进行优化。研究表明,用0.02 mol/1 CuSO4在30℃时对丙烯酰胺修饰的玻片进行5分钟的处理,对Cy5的淬灭效率为97%,核酸的再延伸效率为95%。荧光光谱研究发现硫酸铜对用于核苷酸标记的4种荧光基团(FITC、Cy3、Cy5和TAMAR)淬灭效率从低到高的次序依次为TAMAR>Cy3>FITC>Cy5。实验表明,对于超分支滚环扩增制备的DNA测序模板采用硫酸铜为淬灭剂能够读出42个碱基。
4.基于磁珠的超支滚环扩增的甲基化检测方法
本章发展了基于磁珠的超支滚环扩增的甲基化检测方法,采用超支滚环扩增及固相核酸扩增技术将均匀分布在固相载体中的不同类型的单个单链模板环原位高效地扩增出来,并牢固地固定在原来的位置,形成一种高密度的核酸分子克隆微阵列。通过变性电泳,将微阵列芯片上含有多个相同的核酸片段中未固定的核酸链去除,成功地制备出单条链分子克隆芯片。把阳性克隆和阴性克隆模板的量分别按照0:1,1:O,1:1的比例混合,进行在片扩增,用探针杂交。阳性模板环和阴性模板环对应的红色和绿色的点的比例分别接近于0:1,1:0,1:1,这些结果表明该方法能够检测基因甲基化。
5.基于微乳液滚环扩增的甲基化检测方法
在BEAMing(beads,emulsion,amplification,and magnetic)技术基础上发展了一种DNA甲基化检测和定量分析方法。在乳液中进行超支滚环扩增,每个乳液中至多含有一个磁珠和一个模板。阳性模板环和阴性模板环的比例分别为0:1,1:2,1:1,2:1,1:0,对杂交扫描后的图像上的点进行统计。阳性和阴性模板环扩增产物对应的红点和绿点的个数比分别为:0:149,67:131,91:93,127:65,141:0,与模板中阴性模板与阳性模板的比例是一致,而且至少可以检测到阳性模板环与阴性模板环1:105的滚环扩增产物的甲基化状态,该方法成功检测了10例胃癌组织及相应的癌旁组织的P16基因启动子区域的甲基化。结果证明该方法能够高灵敏度地检测甲基化。