植物药一直是天然药物的重要组成部分,也是人类防病治病的主要来源。恶性肿瘤的发病率呈逐年上升趋势,并且临床上肿瘤耐药时有发生,促使人们将希望寄托于寻找新型的天然抗肿瘤药物,以期发现疗效更好或具有新靶点的化合物。目前为止,世界上许多国家对抗肿瘤新药的研究投入大量的人力和财力,自然界数以百万计的植物、动物、微生物、海洋生物是新药研发的重要源泉。苔藓植物属于高等植物中较低的类别,多数生长在阴暗潮湿的环境中。在植物界的演化进程中,苔藓植物代表着从水生逐渐过渡到陆生的类型,依据形态可分为苔纲(Liverworts)、藓纲(Mosses)(?)角苔纲(Hornworts)3类。苔藓植物含有丰富的次生代谢产物,以萜类和酚类化合物为主,具有广泛的生物学活性。双联苄类化合物是苔藓植物中的一类特征性的组分,近年来的研究表明,双联苄类化合物具有多种生物学活性,包括抗肿瘤、抗细菌、抗真菌等。Riccardin D (RD)是一种双联苄类化合物,目前已经发现其在多种肿瘤细胞中诱导细胞凋亡,然而具体机制还有待进一步研究。另外,RD除了引起细胞凋亡,是否诱导其他类型的细胞死亡如自噬性死亡还没有被证实。在本论文中,我们研究了RD在人类成骨肉瘤U2OS (p53野生)和Saos-2(P53缺失)细胞中诱导细胞死亡的方式和机制。MTT方法揭示RD引起成骨肉瘤细胞U20S和Saos-2浓度和时间依赖性的死亡,而对人类正常成骨细胞则毒性很小。用PI染色流式细胞仪检测发现,RD导致U20S和Saos-2细胞阻滞在G0/G1期；Western blot方法检测RD对细胞周期蛋白的影响,发现RD在两种细胞中都能引起cyclin D和cyclin E这两种G1期蛋白表达水平的下调和细胞周期蛋白抑制剂p21WAF1的上调,同时在U20S细胞中诱导p53表达水平的增加。在p53抑制剂存在的情况下,RD仍然导致U20S细胞G0/G1期阻滞。细胞周期阻滞往往伴随着细胞凋亡,DAPI染色显示RD诱导成骨肉瘤细胞核固缩,断裂；Annexin V/PI双染并用流式细胞仪测定了细胞的凋亡率；Western blot显示RD能够引发caspase依赖的凋亡,同时伴有Bax的降低和Bcl-2的增加。进一步的研究表明,p53抑制剂不影响RD促进凋亡的作用,而caspase抑制剂能够部分逆转RD诱导的凋亡,这表明RD在成骨肉瘤细胞中介导p53非依赖而caspase部分依赖的凋亡。除了细胞凋亡,RD在成骨肉瘤细胞中引起自噬,表现为LC3B-Ⅱ的积累,AVOs的形成,LC3B-Ⅱ焦点和自噬流的增加。自噬阻断剂3MA和E64d能够抑制自噬的过程,明显减弱RD介导的细胞死亡,敲除自噬形成时的一个重要蛋白ATG5的内源性表达也能够抑制自噬流的形成。此外,自噬和caspase的抑制剂联合用药能够明显减少细胞的死亡率。综上所述,RD在成骨肉瘤细胞中同时诱导细胞凋亡和自噬。对于RD抗肿瘤活性的研究取得了初步的进展,然而RD活性中等,这促使我们对其进行修饰合成一系列衍生物以提高生物学活性,并发现更有效的抗癌药物。在各种衍生物中,氨甲基化的产物riccardin D-N (RD-N)(?)舌性较好可以作为一种潜在的候选抗癌药。为了探讨RD-N作用的药理学和分子生物学机制,首先用MTT法对其细胞毒活性进行了检测,RD-N对多种肿瘤细胞都具有抑制活性,其中对前列腺癌PC3的作用比较显著,而对正常细胞则毒性较小,说明RD-N对细胞作用具有选择性。因此,对RD-N机制的研究我们选择前列腺癌PC3、DU145和LNCaP细胞。Annexin V/PI双染并用流式细胞仪测定RD-N对PC3、DU145和LNCaP细胞的凋亡率,,western blot检测凋亡的标志蛋白PARP的剪切,这两个实验说明了RD-N能够诱导前列腺癌细胞凋亡。对于RD-N能否破坏细胞膜,我们采用LDH酶活的测定和PI荧光染色法来评价,实验结果表明RD-N对PC3细胞膜能诱导通透性增加的作用。细胞内ATP的水平随着加药浓度的升高而降低,而ATP的耗竭是细胞凋亡转变为坏死时的一个标志,以上结果说明RD-N同时能够诱导前列腺癌细胞发生坏死。此外对RD-N的亚细胞分布进行了研究,采用蔗糖密度梯度超速离心分离溶酶体和线粒体并且利用HPLC测定化合物在细胞器中的累积,发现在PC3细胞中,RD-N能优先累积于溶酶体内。RD-N累积于溶酶体后,促使溶酶体体积增大,容易发生溶酶体透化作用(LMP)。为了检测RD-N是否引起LMP,我们采用溶酶体的两个特异性探针Lysotracker Red和AO,通过流式细胞仪测定荧光强度,发现RD-N在3种前列腺癌细胞中均产生LMP作用。溶酶体发生LMP后释放组织蛋白酶(cathepsin)入细胞质,cathepsin B的抑制剂而不是cathepsinD和L的抑制剂能够明显逆转RD-N诱导的细胞死亡。另外,RD-N能够通过降低tubulin和(?)ctin的表达而影响细胞骨架系统,使细胞周期阻滞在G2/M期。体内实验表明,RD-N对裸小鼠前列腺癌移植瘤模型有明显的抑瘤作用,H&E和’TUNEL染色显示RD-N是通过引起细胞凋亡的作用机制抑瘤。因此,RD-N体外通过溶酶体损伤诱导细胞死亡,体内能够抑制肿瘤生长。RD-N引起溶酶体膜透化作用释放cathepsin B促使肿瘤细胞死亡,然而cathepsin B具体的作用机制尚未阐明,需要进一步的研究。通过PI或TUNEL染色发现,用小干扰RNA (siRNA)干扰内源性cathepsin B的表达能够明显减少RD-N引起的细胞死亡和染色质溶解,而转染cathepsin B的表达质粒使其过表达则能够促进RD-N引起的细胞死亡和染色质溶解。进一步的实验发现,PC3细胞经过RD-N处理后cathepsin B首先从溶酶体中释放出来然后进入细胞核,整个过程中蛋白表达增加,酶活性增高。RD-N诱导细胞死亡的过程中,同时有DNA损伤的发生,表现为ATM/ATR通路的激活,下游chk2和chkl分别磷酸化,损伤蛋白H2AX和修复蛋白BRCA1的磷酸化。为了寻找cathepsin B引起细胞死亡的下游作用靶点,我们应用激光共聚焦共定位、蛋白-蛋白对接、免疫共沉淀和小干扰RNA等方法,发现cathepsin B进入细胞核以后和BRCA1相互作用并降解BRCA1蛋白,干扰DNA修复的过程,促进RD-N引起的DNA损伤。对于从中药茄属类植物龙葵中分离得到的甾体生物碱类化合物solamargine, solasonine, solasodine和合成的solasodine的两个衍生物抗肿瘤活性的研究,我们发现鼠李糖部分在诱导细胞死亡中起着至关重要的作用,而包含两个鼠李糖基的化合物solamargine表现出最强的抗肿瘤活性。进一步的实验显示,solamargine对不同肿瘤细胞株也表现出不同的细胞毒作用,PC3和KB细胞比HT-29和MCF-7对solamargine更敏感。为了确定皂苷中的糖基如何发挥作用,我们设计合成了生物素化的马铃薯三糖,鼠李糖和葡萄糖与链霉亲和素键合的量子点结合,与肿瘤细胞共同孵育,发现鼠李糖探针和三糖探针的在细胞膜上的红色荧光比葡萄糖探针的荧光强。我们已经知道,鼠李糖对鼠李糖结合受体有高度的亲和性,因此,我们证明了肿瘤细胞膜表面的RBL受体在介导皂苷的抗肿瘤活性方面发挥着重要的作用。通过生物素化的糖和链霉亲和素键合的量子点结合,我们建立了一种原位观察肿瘤细胞膜表面鼠李糖结合凝集素的方法,并且第一次用这种方法观察到了RBL受体。根据该方法,我们检测了不同肿瘤细胞膜表面RBL受体的表达,发现不同的肿瘤细胞或组织有不同的RBL受体的表达,RBL受体高表达的肿瘤细胞对皂苷更为敏感。不同肿瘤细胞表面不同RBL受体表达水平的研究为肿瘤的诊断和药物敏感性研究提供了基础。此外,鉴于鼠李糖在药物吸收中的重要作用,许多化疗药物可以结合鼠李糖,以增加药物的摄取和定位。本论文首次报道了RD除了引起细胞凋亡还能诱导自噬性死亡。为了提高RD的作用效果,合成了新的衍生物RD-N,并证明RD-N是一种靶向溶酶体的药物,通过溶酶体透化作用诱发肿瘤细胞发生凋亡和坏死：溶酶体通透性增加后释放cathepsin B进入细胞核,降解BRCA1同时促进DNA损伤,这是本文发现的cathepsin B的一个新功能。论文还对肿瘤细胞表面的RBL受体进行了研究,发现不同的肿瘤细胞存在不同的RBL受体的表达,RBL受体高表达的肿瘤细胞对solamargine更为敏感,为肿瘤的诊断和药物敏感性研究提供了基础。