WD-重复结构是由约40-60个氨基酸组成的保守蛋白质结构域,大多数含WD-重复结构的蛋白包含4-16个WD-重复结构域,他们构成了WD-重复蛋白超家族。该家族成员的核苷酸序列在真核生物不同物种间高度保守,表明其功能对生命活动的重要性。目前已发现的WD-重复蛋白家族成员多为调节因子,功能涉及信号转导、RNA合成和加工、染色体排列、细胞周期调控、细胞凋亡等多方面,其中最具代表性的成员为G蛋白。MIP2是本室从经历短暂缺血-再灌注的大鼠心肌中发现的表达上调的新基因,命名为缺血预适应上调蛋白2(myocardial ischemic preconditioning upregulated protein 2, MIP2),其GenBank登录号为AY221751。本室前期应用生物信息学的同源性分析和RT-PCR技术克隆得到人的同源新基因MIP2,并利用生物信息学软件对其核酸和蛋白质的结构进行了初步的分析。其最大开放阅读框(open reading frame, ORF)为1497bp,编码498个氨基酸。其编码肽链的N-端含一CTLH结构域,C-端含5个WD40结构域,故为一典型的WD-重复蛋白。在本研究中,我们首先采用生物信息学的多种软件对MIP2核酸和蛋白质的结构、一般生化特性以及生物学功能进行了多方位预测,发现MIP2是一个酸性蛋白,亲水性较弱,疏水性较强；存在信号肽序列的可能性为零,不可能被分泌到细胞外；存在蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点等多种磷酸化位点,推测MIP2基因的活化可能受磷酸化作用的调控。MIP2蛋白的二级结构中,主要以α-螺旋、不规则盘绕和延伸链为蛋白最大量的结构元件,β-折叠散布于整个蛋白质中；三维结构预测发现MIP2蛋白类似环状的螺旋推进器样结构,可提供十分稳定牢靠的蛋白质相互作用的平台,促进多蛋白复合物的形成。SAGE电子表达谱分析表明,MIP2基因在人的大多数正常组织及肿瘤组织中有表达,在心肌中表达较高。虽然MIP2是从大鼠缺血预适应心肌中分离的上调基因,但目前对其表达模式仍不清楚。本研究首先采用大鼠心肌缺血预适应及缺血-再灌注模型,观察心肌中MIP2的mRNA及蛋白质表达模式。研究发现,MIP2的mRNA在单纯缺血预适应、缺血-再灌注、预适应加缺血-再灌注心肌中表达水平均显著升高,且预适应加缺血-再灌注心肌中表达升高幅度最明显；缺血心肌中MIP2的mRNA表达量高于非缺血心肌。心肌缺血及再灌注后,其MIP2蛋白表达水平也增高。采用H9c2心肌细胞氧化应激模型发现,在200μM H2O2处理下,MIP2的mRNA表达明显增加,于4h达高峰,然后逐渐降低,于24h仍处较高水平。在50-200μM H2O2浓度下,MIP2蛋白质表达水平随着H2O2浓度的增加而升高。为观察MIP2的亚细胞定位,我们将包含有人MIP2最大开放阅读框(ORF)的真核表达质粒导入大鼠心室肌H9c2细胞中,建立了稳定过表达MIP2的GFP-MIP2-H9c2单克隆细胞株。通过荧光显微镜观察到MIP2主要定位于胞浆,采用线粒体指示剂MitoTracker发现MIP2部分定位于线粒体。H2O2处理细胞后,其亚细胞定位未见明显改变。为进一步研究MIP2对心肌细胞增殖的影响,我们利用过表达MIP2的H9c2心肌细胞株来观察MIP2对心肌细胞增殖的影响。实验发现,过表达MIP2能促进H9c2心肌细胞的增殖,该促增殖效应与细胞MIP2的表达水平呈量效关系,且MIP2能促进H9c2细胞从G0／G1期向S期的行进、缩短细胞周期。这说明MIP2是一个与细胞增殖有关的基因。同时,在去血清的条件下,过表达MIP2也能加快H9c2心肌细胞的生长。这提示在缺氧及其他损伤因素作用下,MIP2有可能对心肌细胞发挥保护作用。为进一步探讨MIP2对心肌细胞损伤的可能保护作用及其机制,本研究采用H2O2导致H9c2心肌细胞损伤,采用过表达或表达抑制策略探讨MIP2对H2O2所致H9c2细胞氧化应激损伤的影响及其可能机制。结果发现,过表达MIP2能减轻H2O2引起的H9c2细胞损伤及凋亡,能抑制细胞色素C从线粒体中释放,抑制caspase-9和caspase-3活性,但对caspase-8活性无明显抑制作用；运用RNA干扰沉默MIP2基因后,该保护作用明显减弱。上述结果说明,MIP2是通过抑制线粒体凋亡通路而对心肌细胞氧化应激损伤发挥保护作用。