茉莉酸及其信号元件HcJAZ和HcCOI1在姜花花香代谢中的作用

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茉莉酸类物质在植物界中普遍存在,广泛分布于植物的幼嫩组织、花和发育的生殖器官中,与植物的生长发育、自身的防御系统相关。茉莉酸类化合物信号通路的关键因子的不断发现,到COI1-JAZs-MYC2复合体调控模型建立,其通路中的相关因子的调控机理等不断地被阐明,其中JAZ和COI1发挥了至关重要的节点的作用。白姜花(Hedychium coronarium)属姜科姜花属多年生草本植物,花型美丽,气味芳香。本论文以白姜花为研究对象,通过实时荧光定量PCR、酵母双杂交、BiFC、亚细胞定位、HPLC-MS/MS测定内源激素和GC-MS测定挥发性物质等技术,研究了内源茉莉酸以及外源茉莉酸处理不同花发育时期白姜花对茉莉酸信号途径关键基因HcJAZ和HcCOI1对花香释放以及相关基因的调控,为白姜花茉莉酸途径在姜花香气释放中所发挥的作用打下理论基础。本文取得的主要结果如下:1、利用RT-PCR技术,从白姜花的花朵中克隆三个JAZ和COI1的c DNA全长序列,并分别命名为HcJAZ1,Hc JAZ2,HcJAZ3以及HcCOI1-1,HcCOI1-2,HcCOI1-3。序列分析表明,HcJAZ1,HcJAZ2,Hc JAZ3基因cDNA的ORF为708bp,780bp,687bp,分别编码235,259,228个氨基酸。HcCOI1-1,HcC OI1-2,HcCOI1-3 c DNA的ORF长1764bp,1728bp,1761bp,分别编码587、575、586个氨基酸。氨基酸序列分析表明HcJAZ均含有保守的TIFY和CCT2结构域,HcCOI1含有F-box、AMN1、LRR结构域。系统进化分析表明,与拟南芥的JAZ相比,HcJAZ1和HcJAZ2与At JAZ1和AtJAZ2亲缘关系相对最近,HcJAZ3与AtJAZ9亲缘关系相对最近。HcCOI1-1和HcCOI1-3与单子叶植物唐菖蒲的GhCOI1和凤梨的AcCOI1同源性较近,而HcCOI1-2则和小果野蕉的MnTIR1具有同源性。2、分别构建HcJAZ以及HcCOI1酵母双杂交载体,设计共转组合。酵母双杂交分析结果表明:HcJAZ2、HcJAZ3可以和转录因子HcMYB1和HcMYC2结合,同时HcJAZ3也能结合HcCOI1-2蛋白以及转录因子HcIAA2,并且在HcJAZ3的Jas结构域发生相互作用。HcCOI1-2蛋白也同时能和HcIAA2相互结合。3、分别构建了HcJAZ3-YCE和HcCOI1-2-YNE的BiFC融合表达载体,结果进一步验证了HcJAZ3分别和HcMYB1、HcMYC2以及HcCOI1-2的相互作用。筛选出重要基因HcJAZ3和HcCOI1-2。4、分别构建了HcJAZ3以及HcC OI1-2全长的GFP瞬时表达载体,转化拟南芥原生质体,并用细胞核染料DAPI染色,以空载p35S-GFP为阴性对照,结果表明HcJAZ3定位于细胞核,HcCOI1-2定位在质体。5、时空表达特性分析结果表明HcJAZ3在花瓣,根以及地下茎的表达量相对较低,而在地上茎和叶中表达量非常高。HcCOI1-2在不同组织中均有表达,且在花瓣,根以及地下茎的表达量相对较低,而在地上茎和叶中表达量相对较高。HcJAZ3和HcCOI1-2在青蕾期均有较高的表达,在外苞始放期表达量降到较低值,随后HcJAZ3在初开期达到一个峰值,而HcCOI1-2在花苞微开期达到峰值,HcJAZ3在盛开期达到一个低谷,而HcCOI1-2在盛开前期达到低谷,在衰败期又有一定量的回升。两者呈现出相似的规律。HcJAZ3在白姜花中表达量低,而在红姜花当中表达量高,HcCOI1-2在金姜花中表达量高。6、提取白姜花花发育不同时期内源茉莉酸,利用HPLC-MS/MS方法分析检测白姜花内源茉莉酸含量的变化规律,结果表明内源茉莉酸的含量在白姜花中整体呈现出明显的上升趋势,在外苞始放期有小幅度上升的峰值,在盛开期达到最大峰值,进入衰败期茉莉酸含量有所下降。7、外源激素JA处理不同时期的白姜花至盛开期后,各个时期的花香变化规律不一致,筛选出变化较为明显的外苞始放期和初开期处理后白姜花,在处理后1.8-桉油醇分别上升19%和56%。苯甲酸甲酯下降33%和10%。罗勒烯在初开期处理,上升20%。沉香醇在外苞始放期和初开期处理,分别上升23%和8%。这说明,JA处理不同起始时期白姜花至盛开对其花香释放有一定影响。茉莉酸途径的关键转录因子HcMYB1的表达量在这两个时期分别上升了2.2和3.2倍。而Hc MYC2的表达量在外苞始放期处理后上升60%。除此之外,HcJAZ3的表达量则分别下降了35%和63%。HcCOI1-2的表达量在外苞始放期上升了1倍,而在初开期处理后则基本无变化。参与调控苯丙烷类途径香气物质合成的功能基因如HcBSMT2的相对表达量在外苞始放期处理后表达基本不变,在初开期处理后下降15%。参与萜类合成途径香气物质合成的功能基因HcTPS基因表达大部分都呈现上升趋势,其中变化量较大的Hc TPS1表达量均上升一倍。Hc TPS3在两个时期上升12%和9%。与花香合成相关的功能基因表达量的变化情况与GC-MS结果基本一致。
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