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鱼类病毒性神经坏死病（Virus nervous necrosis,VNN）是由神经坏死病病毒（Nervous necrosis virus,NNV）引起的一种严重威胁世界水产养殖业的传染性疾病,可导致120多种鱼类不同程度的损伤,严重制约了水产养殖业的可持续发展。本研究从病毒的分离鉴定、单克隆抗体的制备和逃逸宿主Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）反应三个方面进行研究,以期为后续建立石斑鱼神经坏死病毒的快速检测方法、解析其致病机制和筛选抗病毒药物靶点提供了工具和理论基础。具体研究内容和结果如下:1、RGNNV的分离和鉴定:通过RT-PCR、细胞培养、组织切片和电镜观察等技术从广东某养殖场患病的杂交虎龙石斑鱼成鱼中分离鉴定出一株石斑鱼神经坏死病毒。肉眼观察患病鱼呈体色发黑、眼球突出、腹部膨大、侧翻打转等临床症状,发病水温28℃,对可能造成石斑鱼发病的病原进行PCR检测,结果只有NNV的T4引物扩增出条带,测序结果表明该产物与Genbank中已报道的NNV衣壳蛋白（Cp）序列相似性最高。组织切片表明患病鱼脑部可见明显的空斑,而且患病鱼脑组织匀浆液过滤除菌后接种的SSN-1细胞、GF-1细胞和GS细胞出现明显的细胞病变效应（CPE）。蔗糖密度梯度离心获得高纯度的病毒,电镜下该病毒粒子呈球形,是典型的NNV形态。分段扩增获得RNA1和RNA2全长,进化树分析结果显示分离得到的病毒属于NNV中的RGNNV基因型,命名为RGNNV-HL。浸泡感染和腹腔注射RGNNV-HL均能导致实验鱼大量死亡,14天累计死亡率分别为90%和83.3%。2、抗RGNNV衣壳蛋白（Cp）单克隆抗体的制备:首先扩增获得衣壳蛋白（Cp）的开放阅读框,双酶切后连接至pET-28a质粒得到融合衣壳蛋白的表达质粒（pET-28a-Cp）,转化后挑取含有pET-28a-Cp的BL21（DE3）阳性克隆进行IPTG诱导。SDS-PAGE结果表明42 kDa处有明显加粗蛋白条带。Ni+柱纯化后获得高纯度融合表达的衣壳蛋白（rCp）。以rCp为免疫原免疫Balb/c小鼠,经过细胞融合、HAT筛选、酶联免疫吸附实验和有限稀释法克隆后得到三株可以持续分泌抗RGNNV衣壳蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞。免疫印迹实验（western blot）表明三株单抗均能特异性识别RGNNV的衣壳蛋白。间接免疫荧光（IFAT）结果显示,三株单抗均可特异性识别RGNNV病毒粒子,可以用于后续RGNNV快速检测方法的建立。3、RGNNV B2蛋白抑制RLRs介导的Ⅰ型干扰素反应的机制研究:首先,笔者发现RGNNV感染能显著抑制poly（I:C）激活的IFNφ1启动子活性。分别过表达RGNNV的结构蛋白和非结构蛋白,检测它们对IFNφ1启动子活性的影响,结果表明RGNNV的A蛋白明显上调IFNφ1启动子活性,而B1蛋白和B2蛋白抑制IFNφ1启动子的活化且B2蛋白的抑制能力更强,因此选择B2蛋白进一步研究。将B2蛋白和RLRs信号通路关键分子共表达以期筛选出其靶向分子,结果表明B2蛋白显著抑制共表达分子活化IFNφ1启动子的能力。免疫印迹实验表明B2蛋白能抑制所有共转RLRs信号通路接头分子的表达,接着笔者发现B2蛋白能明显降低组成型启动子（CMV）的启动活性,笔者猜测B2蛋白可能是一个宿主转录或翻译抑制因子。为了验证这一猜想,笔者分别检测了过表达B2蛋白后CMV启动子启动的荧光素酶的mRNA表达量和稳定性,结果表明过表达B2蛋白后荧光素酶的mRNA水平明显降低但其稳定性并无显著变化,至此确定B2蛋白抑制宿主的转录。由于RNA聚合酶Ⅱ（RNAPⅡ）在宿主的转录过程中发挥着不可或缺的作用,因此检测了B2蛋白对RNAP Ⅱ的影响,结果表明B2蛋白可抑制RNAP Ⅱ的表达和磷酸化,而且B2蛋白的这种功能并不受其线粒体定位的影响。至此确定RGNNV B2蛋白通过影响RNAPⅡ及其磷酸抑制细胞转录间接抑制RLRS介导的Ⅰ型干扰素反应。