论文部分内容阅读
目的研究甲磺酸阿帕替尼(Apatinib)、黄连素(Berberine,BBR)及两药联合对Hep-G2细胞增殖、凋亡的影响,及抗增殖B细胞相关易位基因(The B-cell translocation gene-2,BTG2)和细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1 m RNA及蛋白的表达情况,以探索其可能的机制;明确两药联合在抑制肝癌细胞增殖、促进调亡及影响BTG2和Cyclin B1、Cyclin D1 m RNA及蛋白表达方面,是否具有协同效应;并进一步探讨中药提取物BBR在肝癌治疗中的作用及可行性。方法1.CCK-8法检测Apatinib、BBR单独对人肝癌细胞Hep-G2细胞增殖的抑制作用及时间量效关系,取Apatinib、BBR干预细胞24h后的抑制率为25%的值,并将这两个值相加作为两药联合组的药物作用浓度,进一步检测两药联合对Hep-G2细胞增殖的抑制作用;2.流式细胞术检测Apatinib、BBR两药单独及联合作用对细胞周期及凋亡的影响;3.实时荧光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)检测Apatinib、BBR两药单独及联合干预细胞后,抗增殖基因BTG2及细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1的m RNA表达情况;4.蛋白印迹法(Western blotting,WB)检测Apatinib、BBR两药单独及联合干预细胞后,抗增殖基因BTG2及细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1的蛋白表达情况。结果1.Apatinib、BBR单独及联合作用对人肝癌细胞Hep-G2增殖抑制的影响(1)CCK8检测不同浓度梯度的Apatinib单独作用于人肝癌细胞Hep-G224h、48h、72h后对细胞增殖抑制的影响,人肝癌细胞Hep-G2的抑制率与Apatinib的浓度之间存在时间剂量依赖性(P<0.01),随着Apatinib作用浓度及时间的增加,人肝癌细胞Hep-G2抑制率随之增加,当Apatinib的浓度为0.5μM/L时,Apatinib对人肝癌细胞Hep-G2抑制率为25%。(2)CCK8检测不同浓度梯度的BBR单独作用于人肝癌细胞Hep-G2 24h、48h、72h后对细胞增殖抑制的影响,人肝癌细胞Hep-G2的抑制率与BBR的用药浓度存在时间剂量依赖性(P<0.01),随着BBR作用浓度及时间的增加,人肝癌细胞Hep-G2抑制率随之增加。当BBR的浓度为30μM/L时,BBR对人肝癌细胞Hep-G2抑制率为25%。(3)根据CCK8实验结果,选择Apatinib(0.5μM/L)和BBR(30μM/L)作为后续实验及两药联合组所用药物浓度,并检测特定浓度的两药单独及联合作用于人肝癌细胞Hep-G2 24h、48h、72h后对细胞增殖抑制的影响,发现人肝癌细胞Hep-G2的抑制率与两药单独及联合均存在时间依赖性(P<0.01),随着作用时间的延长,人肝癌细胞Hep-G2抑制率随之增加,且两药联合组的细胞增殖抑制率明显高于Apatinib、BBR单药组(P<0.01),差异有统计学意义。(4)RT-PCR及Western Blot检测Apatinib、BBR单药组及联合处理人肝癌细胞Hep-G2 24h后细胞抗增殖基因BTG2 m RNA及蛋白的表达,与对照组相比,Apatinib、BBR两药单独及联合组均可上调BTG2 m RNA及蛋白表达(P<0.01);与两单药组相比,两药联合组上调BTG2 m RNA及蛋白的表达更显著(P<0.01),差异有统计学意义。2.Apatinib、BBR单独及联合作用对人肝癌细胞Hep-G2细胞周期的影响(1)流式细胞仪检测Apatinib、BBR两药单独及联合处理人肝癌细胞Hep-G2 24h后对细胞周期影响。结果显示,与对照组相比,Apatinib单独干预人肝癌细胞Hep-G2时,G0/G1期中的百分比明显增加(P<0.01),S期及G2/M期细胞占比减少(P<0.01),表明Apatinib可引起人肝癌细胞Hep-G2G0/G1期的细胞周期阻滞。与对照组相比,BBR单独作用人肝癌细胞Hep-G2时,G2/M期的细胞占比明显增加(P<0.01),G0/G1期及S期相对减少(P<0.01),表明BBR可引起人肝癌细胞Hep-G2 G2/M期的细胞周期阻滞。与对照组相比,两药联合组干预人肝癌细胞Hep-G2时,G0/G1期中的百分比明显增加(P<0.01),S期及G2/M期细胞占比减少(P<0.01),表明联合组可引起人肝癌细胞Hep-G2 G0/G1期的细胞周期阻滞。(2)RT-PCR及Western Blot检测Apatinib、BBR两药单独及联合处理人肝癌细胞Hep-G2 24h后细胞周期相关蛋白Cyclin B1、Cyclin D1m RNA及蛋白的表达水平变化,我们发现,与对照组相比,Apatinib、BBR两药单独及联合组均可引起Cyclin B1、Cyclin D1 m RNA及蛋白表达的下调(P<0.01);与两单药组相比,两药联合组下调Cyclin B1、Cyclin D1 m RNA及蛋白的表达更显著(P<0.01),差异有统计学意义。3.Apatinib、BBR单独及联合作用对人肝癌细胞Hep-G2细胞凋亡的影响流式细胞仪检测Apatinib、BBR单独及联合处理人肝癌细胞Hep-G224h、48h、72h后,细胞的凋亡率的变化。结果显示,与对照组相比,Apatinib、BBR两药单独及联合干预Hep-G2细胞时,均可促进Hep-G2细胞凋亡(P<0.01),且凋亡率与三组药物作用时间成正相关(P<0.01或P<0.05)。与各时间点两单药组相比,两药联合组Hep-G2细胞凋亡率更高(P<0.01),差异具有统计学意义。结论1.Apatinib、BBR两单药均能够抑制肝癌Hep-G2细胞增殖,且具有时间剂量依赖性;其机制可能与上调抗增殖基因BTG2 m RNA及蛋白的表达相关。2.Apatinib、BBR两药联合组对肝癌Hep-G2细胞增殖的抑制作用具有时间依赖性,且具有叠加效应(协同增殖抑制);3.Apatinib、BBR两单药及联合组均可下调Cyclin B1、Cyclin D1 m RNA及蛋白的表达引起细胞周期阻滞;并可促进细胞凋亡,且具有时间依赖性;4.Apatinib、BBR均能从分子机制水平为肝癌的临床治疗提供依据,且两种药物联合应用,疗效更明显。