研究背景：　　肾癌是起源于肾小管上皮细胞的一种常见肾脏恶性肿瘤，占成人全部恶性肿瘤的2-3％，占肾脏原发恶性肿瘤的85-90％，其中80-90％为透明细胞癌，并且发病率呈逐年上升的趋势。目前肾癌的发病机制还不是十分清楚，放化疗效果不佳，虽然根治性肾切除术被认为是最有效果的治疗方法，然而进展期肾癌的5年生存率低于10％。转移是影响肾癌治疗效果、造成患者死亡的重要原因。肾癌的转移率很高，当肾癌发现时约有33％已经出现了远处转移，行根治性肾切除术后仍有20-40％的患者出现远处转移，常见的转移部位有肺、肝脏、骨等。因此，研究肾癌转移的机制、寻找关键的转移相关因子并控制肾癌转移是目前急需解决的问题。　　ALDH1A1，为ALDHs（aldehyde dehydrogenases，乙醛脱氢酶）基因超家族成员之一。ALDHs超家族编码的蛋白是一类NAD(P)+依赖的酶，催化外源性和内源性的脂肪族和芳香族醛类氧化成相应的羧酸。ALDH1A1定位在人类9号染色体长臂21区13亚区上。编码的蛋白为同源四聚体细胞浆蛋白(亚基的大小约为55kD)，在脑、角膜、晶状体、视网膜、肝以及胃肠道上皮细胞等组织中表达。ALDH1A1是目前已知的脊椎动物中四种视黄醛脱氢酶其中之一，在文献中又称为RALDH1，其与全反式视黄醛和9-顺式视黄醛具有极高的亲和力，且与乙醛也有较高的亲和力。维甲酸(RA)是一种小分子量(300Da)、脂溶性且可以迅速扩散的信号分子，是胚胎生长和发育过程中必不可少的物质。其在体内经过两次酶促反应生成。维生素A（全反式视黄醇）由特异的酒精或微粒体视黄醇脱氢酶催化生成视黄醛，然后由细胞浆视黄醛脱氢酶催化形成维甲酸。ALDH1A1是第一个被证实不可逆地催化视黄醛形成视黄醛的羧酸形式，即维甲酸。有几项应用转基因鼠和基因敲除鼠进行的研究证实ALDH1A1基因在胚胎发育和器官形成过程中起着重要作用。最近的研究显示ALDH1A1是肿瘤干细胞标志之一，并且与多种实体瘤患者预后存在相关性。但是目前ALDH1A1在肾癌组织中的表达以及在肾癌中作用机制，鲜见文献报道。ALDH1A1与膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多种实体瘤患者预后密切相关性。ALDH1A1阳性癌细胞的增殖、侵袭和转移能力在体内和体外实验中均明显高于ALDH1A1阴性的癌细胞。以上结果提示ALDH1A1是导致肿瘤发生发展的重要机制和潜在逆转靶点之一。但是在肾癌中ALDH1A1的表达如何，其活性是如何被调控的？目前未见报道。　　miRNA是一类近年来发现的长度为21-25nt，具有基因调控功能的内源性非编码小RNA分子。miRNA主要来自60-110个碱基组成的发夹环结构，是一系列酶切反应的产物，先在核内由drosha酶（也被称为核糖核酸酶3）剪切，然后在胞质中由dicer酶剪切而来。miRNA通过与靶基因的mRNA3UTR互补配对的位点不同程度匹配结合，诱导靶基因降解或遏制其转录后翻译，从而发挥重要的调控作用，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等过程。目前研究发现，miRNA作为一种重要的转录后调控因子，广泛的参与了肿瘤相关基因的调控。大约有50％的miRNA基因位于基因组中的脆性位点或癌症相关区域，这些部位往往是癌细胞染色体交换、转位、扩增或基因异常整合的区域。这些与肿瘤相关的miRNA通过靶向控制癌基因或抑癌基因来发挥其作用。近来研究发现，miR-335在肾癌组织中低表达，提示miR-335可能参与肾癌的发生和发展，但其机制目前未见报道。　　目的：　　本研究目的是明确miR-335及ALDH1A1在肾癌组织中的表达及其意义，并分析两者之间的关系。同时在细胞水平，通过转染miR-335模拟物，进一步明确miR-335对肾癌细胞内源性ALDH1A1表达和肾癌侵袭转移能力的影响，初步探索miR-335在肾癌中的作用及其是否靶向ALDH1A1调控肾癌细胞的侵袭转移。　　方法：　　通过回顾性研究选取95例肾癌组织标本及23例正常肾组织，通过免疫组化检测ALDH1A1在肾癌和正常组织的差异表达，并分析肾癌中ALDH1A1表达与患者的临床病理资料和预后的相关性;选取20例肾癌新鲜的标本及配对的癌旁组织，通过Realtime PCR检测miR-335和ALDH1A1 mRNA表达，Western Blot检测ALDH1A1蛋白表达，并通过Pearson相关分析分析二者的相关性;另选取人正常肾小管上皮细胞(HK-2)为对照，选取二株肾癌细胞（786-O和769-P）作为实验组，Realtime PCR检测肾癌细胞ALDH1A1 mRNA的表达差异，并通过基因沉默技术沉默肾癌细胞（786-O和769-P）ALDH1A1表达，观察肾癌细胞侵袭转移能力的变化;利用miR-335模拟物转染肾癌细胞（786-O和769-P），Transwell小室检测miR-335过表达对肾癌细胞侵袭和迁移能力的影响，Realtime PCR和Western Blot检测miR-335过表达对ALDH1A1的mRNA和蛋白表达的影响;利用双荧光素酶报告基因进一步验证miR-335对ALDH1A1的靶向调控作用。　　结果：　　随访性研究结果显示，ALDH1A1高表达与肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移、复发及患者不良预后相关。新鲜肾癌组织中Realtime PCR结果显示，miR-335在肾癌组织中特异低表达，ALDH1A1在肾癌组织中特异高表达，且两者具有较好的负相关性;细胞水平Realtime PCR结果显示，miR-335在肾癌细胞中特异低表达，ALDH1A1在肾癌细胞中特异高表达，与组织水平表达趋势一致;肾癌细胞中ALDH1A1沉默后，肾癌细胞侵袭和迁移能力下降;miR-335模拟物转染肾癌细胞（786-O和769-P），miR-335mimic过表达，肾癌细胞侵袭和迁移能力下降，同时ALDH1A1表达受到显著抑制;双荧光素酶报告基因显示miR-335可与ALDH1A1 mRNA3UTR靶向结合。　　结论：　　ALDH1A1高表达与肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移、复发及患者不良预后相关;miR-335与ALDH1A1表达在肾癌组织和细胞水平均成负相关;ALDH1A1沉默可抑制肾癌细胞的侵袭和迁移能力;miR-335可抑制肾癌细胞的侵袭和迁移能力;miR-335通过靶向结合ALDH1A1 mRNA3UTR上预测的miR-335结合位点抑制ALDH1A1蛋白的表达。