目的:哺乳动物成熟个体中的心肌细胞是终末分化的细胞,受到损伤时一般由瘢痕进行替代修复,由此造成的心肌细胞缺失和数量下降是导致心脏收缩功能下降,进而引起心力衰竭等心脏疾病的重要原因。近年来的研究表明,成体心脏中的心肌干细胞数量极少,不能对受损的心肌起到修复作用,加上心脏移植疗法的供体、免疫原性和费用的限制,现在众多研究者把目光投向细胞移植治疗取代坏死的心肌细胞、增加有功能的心肌细胞数量。动物实验也证实移植的骨髓间充质干细胞、新生心肌细胞甚至骨骼肌细胞都可以在一定程度上改善心功能,但是细胞移植的研究还有很多亟待解决的难题,首要难题之一就是上述用于移植的细胞向心肌细胞的转化效率太低,得不到移植所需的大量有收缩功能的心肌细胞。因此探索在心肌分化过程中的具体机制将具有重要意义,许多研究者推测心肌分化的过程始于某个或某些关键基因的启动,通常这些基因的蛋白产物都是转录因子,它们可以使下游的靶基因呈级联式地激活,直至分化完成。同源盒基因Nkx2-5又称为心脏特异性同源盒基因(cardiac specific homeobox, Csx),是所有脊椎动物心脏发生中最早表达的转录因子之一,也是目前研究最多的与心脏发育和心肌分化密切相关的转录因子之一,与早期研究发现的、决定果蝇心脏发育的tinman基因为同源基因,Nkx2-5属于NK2型同源盒基因家族成员。该基因在复杂的心脏发育程序中起重要调控作用,许多研究表明Nkx2-5的表达对于胚胎心肌细胞的形成极为重要。在非洲蟾蜍胚胎,过表达Nkx2-5可以导致由心肌数目增多引起的心脏增大。注射Nkx2-5到斑马鱼的胚胎导致心肌数目增多,心脏增大,将表达Nkx2-5的细胞移植至生心区以外的组织可引发心脏标志物的转录和表达。国外也有报道Nkx2-5的表达可促进P19细胞和P19CL6细胞向心肌细胞分化,提高心特异基因的表达,且保护心肌免受胁迫引起的损害。研究证实,Nkx2-5基因调控心纳素、心脏α-actin,心锚蛋白重复序列蛋白、A1腺甙受体、钙网织蛋白、间隙连接蛋白40等基因的表达。这些目的基因编码重要的结构蛋白转录调控心肌特性,说明Nkx2-5有转录调控心肌程序的功能。但Nkx2-5的表达能否使哺乳类干细胞产生有收缩功能的心肌细胞以及使非心肌细胞分化为心肌细胞仍有不同争议。而且国内关于Nkx2-5在心肌分化中作用的相关报道少而又少,因此本研究拟做该方面的研究。P19胚胎癌细胞(embryonal carcinoma cells, EC)是从C3H/He雄性小鼠畸胎瘤中诱导形成的EC细胞系,体外培养经多次传代仍保持胚胎干细胞的特性。P19细胞经诱导可分化为包括心肌在内的多种细胞,在P19细胞向心肌分化的过程中,其细胞发育相关基因的表达及电生理特性与正常小鼠心肌发育过程相似,且该细胞易于进行基因操作,是研究心肌细胞发育的良好体外模型。因此,本课题拟将Nkx2-5基因转染P19细胞,并筛选出稳定表达Nkx2-5的P19细胞,观察其在没有诱导剂的情况下向心肌分化的情况。并研究在5-氮胞苷(5-azacytidine, 5-aza)的作用下,稳定表达Nkx2-5的P19细胞在单层培养时向心肌分化的情况,以阐明心肌细胞分化过程中的一些规律,为各种干细胞有效转化为心肌细胞提供策略。方法:1 pEGFP-N1-Nkx2-5真核表达质粒的构建、鉴定由日本Hiroshi Akazawa博士惠赠的pEFSA-HA-Nkx2-5质粒,经常规CaCl2法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,扩增提取之后经XbaI,HindⅢ双酶切鉴定。以pEFSA-HA-Nkx质粒为模板,PCR扩增Nkx2-5基因全长,琼脂糖凝胶电泳,割胶回收靶片断。再以扩增的Nkx2-5基因全长为模板,PCR扩增Nkx2-5基因编码框,琼脂糖凝胶电泳,割胶回收靶片断。PCR扩增的Nkx2-5基因编码框和载体pEGFP-N1分别经BamHI和XhoI双酶切过夜,分别回收后将二者连接,置16℃恒温过夜。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,涂布于含卡那霉素的固体LB培养基上,37℃倒置培养16～24 h;挑取单个阳性菌落,提取重组质粒,进行菌落PCR鉴定有无目的片段,再经BamHI、XhoI双酶切鉴定,同时将构建质粒送上海生工生物工程技术公司测序。2外源表达Nkx2-5诱导聚集P19细胞向心肌分化实验分转染组和未转染组。转染组转染之前通过预实验确定合适的细胞接种密度,转染最佳体系,G418筛选浓度。本实验采用阳离子转染试剂Lipofectamine2000将质粒pEGFP-N1-Nkx2-5转染P19细胞,转染之后24h将细胞1:10比例传代,G418稳定筛选两周后,将筛出细胞聚集培养四天形成聚集体,聚集体移入培养皿中贴壁生长。在贴壁的4天、8天、12天、16天取细胞,免疫细胞化学检测desmin、α-sarcomeric actin和cTnT的表达;免疫荧光双标检测α-sarcomeric actin和cTnT的共表达;RT-PCR检测GATA-4、α-MHC、ANP基因的表达;Western blot检测α-sarcomeric actin和cTnT蛋白的表达。并取贴壁16天的细胞透射电镜观察超微结构的变化。未转染组将P19细胞直接聚集培养,观察分化的情况,未转染组检测指标和取材时间同转染组。3 5-氮胞苷诱导外源表达Nkx2-5的P19细胞单层培养时向心肌分化实验分为实验组和对照组,实验组为5-aza诱导的稳定表达Nkx2-5基因的单层培养P19细胞,对照组为5-aza诱导的单层培养P19细胞。用1μmol/L的5-aza浓度分别对实验组和对照组的细胞进行诱导。在诱导的4天、8天、12天、16天取细胞,免疫细胞化学检测α-sarcomeric actin和cTnT的表达;免疫荧光双标检测α-sarcomeric actin和cTnT的共表达;RT-PCR检测GATA-4、α-MHC和ANP基因的表达;Western blot检测α-sarcomeric actin和cTnT的蛋白表达;并取实验组诱导16天的细胞透射电镜观察超微结构变化。结果:1 pEGFP-N1-Nkx2-5真核表达质粒的构建、鉴定pEFSA-HA-Nkx2-5质粒经XbaI,HindⅢ双酶切鉴定含有约1500bp的基因片段,与人Nkx2-5基因全长(1585bp)大小一致,所以pEFSA-HA-Nkx2-5质粒确含有人Nkx2-5基因全长。以pEFSA-HA-Nkx2-5质粒为模板,第一次扩增出约1500bp的基因片段,与人Nkx2-5基因全长大小一致;以基因全长为模板,第二次扩增出约1000bp的基因片段,与人Nkx2-5基因编码框(974bp)大小一致。酶切Nkx2-5基因的编码框及克隆用载体pEGFP-N1分别得到带有BamH I和Xho I酶切位点的基因片段(约900bp)和载体(4.7kb),分别回收连接。连接产物转化后,筛出新生菌落PCR显示可以扩增出大小约1000bp的目的条带,抽提重组质粒,经BamH I和Xho I双酶切之后,可获得约1000bp和4.7kb的条带。用启动子CMV引物测序,测序结果经与Gene Bank查询的人Nkx2-5基因编码框比对,98%一致。且基因起始端Kozak序列完全,基因终止子已经突变、读码框正确。确定在本研究中,pEGFP-N1-Nkx2-5重组质粒构建成功。2外源表达Nkx2-5诱导聚集P19细胞向心肌分化实验确定,转染细胞传代密度:2×105/ml;转染的最佳体系:采用质粒DNA(μg)和转染试剂Lipofectamine2000(μl) 1:3的比率;G418稳定筛选浓度:700μg/ml。转染组在转染质粒pEGFP-N1-Nkx2-5之后的24h可见部分P19细胞表达Nkx2-5-EGFP融合蛋白,700μg/ml G418筛选14天后,大多数细胞具有绿色荧光,这些细胞为外源表达Nkx2-5的P19细胞。转染组和未转染组的细胞聚集培养4天形成聚集体,聚集体贴壁培养后细胞由周边爬出形成生长晕,晕中细胞胞体变大变长,伸出突起、彼此相连。在转染组,免疫细胞化学结果显示:Desmin、α-sarcomeric actin和cTnT三种抗体4天的时候都没有表达,8天、12天、16天时三种抗体均有表达,呈逐渐增高的趋势。12天、16天的细胞中有明显棕黄色成束样结构。Desmin在16天、12天的表达量与8天比有显著差异(P<0.01);α-sarcomeric actin在16天的表达量与8天比有显著差异(P<0.01);cTnT的表达16天与8天比有显著差异(P<0.01)。免疫荧光双标结果显示α-sarcomeric actin和cTnT两种抗体在贴壁培养的8天、12天、16天时共表达,且表达量呈逐渐增高趋势,两种蛋白在同一细胞相同部位重叠表达。RT-PCR分析结果显示:转染组GATA-4在贴壁培养的4天有表达,8天、12天表达逐渐增多,16天时表达有所下降。α-MHC和ANP在贴壁培养的8天有表达,12天和16天时表达逐渐增多。统计结果表明GATA-4表达量8天、12天、16天与4天比有显著差异(P<0.05或P<0.01),α-MHC在12天、16天的表达量与8天比有显著差异(P<0.05,P<0.01),ANP在16天的表达量与8天比有显著差异(P<0.01),16天表达量与12天比也有显著差异(P<0.01);Western Blot结果显示:两种蛋白都是在8天的时候有表达,12天和16天时表达量逐渐增高,统计结果显示12天、16天时α-sarcomeric actin的表达量与8天相比有显著差异(P<0.01),16天的表达量与12天相比也有显著差异(P<0.01)。cTnT 12天、16天的表达量与8天相比有显著差异(P<0.01),16天的表达量与12天相比,也有显著差异(P<0.01)。电镜观察发现转染组的细胞经聚集、贴壁培养16天后,部分细胞胞体呈长柱形,相邻细胞间互相连接在一起,而且出现特化的细胞连接结构,连接的两侧胞质内出现微丝样结构。部分细胞的胞质中,出现密集平行排列的肌丝样结构,但未见到肌节样结构。培养过程中转染组细胞没有出现心肌样跳动。未转染组免疫细胞化学、免疫荧光双标、RT-PCR和Western Blot结果均呈阴性,电镜观察未见分化的细胞。3 5-氮胞苷诱导外源表达Nkx2-5的P19细胞单层培养时向心肌分化在5-aza诱导时,实验组和对照组的细胞较未加诱导剂的P19细胞生长缓慢,每日有多个细胞死亡、变圆漂浮。随着细胞数目增多,聚集成类似于聚集体贴壁生长的状态,中心细胞小、密集,周边细胞爬出,呈放射状排列,胞体变长呈梭形,并伸出突起。细胞形成聚集生长之后,死亡细胞变少。两组在培养过程中都没有发现细胞跳动现象。实验组在5-aza诱导后8天两种抗体有阳性表达,12天、16天的表达量逐渐增多,细胞中棕黄色成束丝样结构增多。统计结果显示:α-sarcomeric actin的表达,16天与8天比有显著差异(P<0.01),16天与12天比也有显著差异(P<0.01)。cTnT的表达16天与8天比有显著差异(P<0.01)。对照组细胞在5-aza诱导的4、8、12、16天均没有检测到α-sarcomeric actin和cTnT的阳性表达。免疫荧光双标结果显示:在实验组,α-sarcomeric actin和cTnT两种抗体在5-aza诱导的第8天、12天、16天时有表达,且表达量呈逐渐增高的趋势,两种蛋白在同一细胞相同部位重叠表达。对照组没有两种蛋白的共表达。RT-PCR结果显示:实验组GATA-4在诱导的4天有表达,8天、12天、16天表达逐渐增多。α-MHC和ANP在5-aza诱导后的8天有表达,12天和16天表达逐渐增多;统计结果表明:GATA-4表达量12天、16天与4天比有显著差异(P<0.01),16天与8天比有显著差异(P<0.01),16天与12天比也有显著差异(P<0.05)。α-MHC在16天、12天的表达量与8天比有显著差异(P<0.01),16天的表达量与12天比有显著差异(P<0.01)。ANP在16天、12天的表达量与8天比增高,有显著差异(P<0.01),16天表达量与12天比增高,有显著差异(P<0.05)。在对照组,ANP没有表达;GATA-4在8天、12天、16天有表达,表达量逐渐增高,4天时没有表达。α-MHC在12天、16天时有表达。统计结果显示:GATA-4的表达只有16天与8天比有显著差异(P<0.05)。α-MHC在12天、16天时的表达没有显著差异。RT-PCR结果在两组之间有差异,实验组细胞GATA-4、α-MHC表达提前,且在各个时间点,实验组细胞两个基因的表达量与对照组相比均增高,除了α-MHC在12天的表达两组间没有显著差异,其他时间点都有显著差异(P<0.01或P<0.05);对照组ANP没有表达,而在实验组ANP有表达。Western Blot结果显示:实验组细胞α-sarcomeric actin和cTnT在8天、12天和16天时有表达,且表达逐渐增高;在实验组,16天、12天时α-sarcomeric actin的表达与8天比有显著差异(P<0.01),16天与12天比也有显著差异(P<0.05)。16天、12天时cTnT的表达与8天比有显著差异(P<0.01);对照组两种蛋白没有表达。实验组电镜观察发现部分细胞相邻处分化出细胞连接,连接的两侧胞质内出现微丝样结构。有些相邻细胞间伸出相互嵌合的突起并分化出幼稚的细胞连接,类似心肌闰盘的早期结构。部分细胞的胞质中,可见密集平行排列肌丝样结构,肌丝样结构上有电子密度高的区域,类似于幼稚的明暗带结构或平滑肌的密斑密体结构。结论:1成功扩增出人Nkx2-5基因编码框;成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5,为以后研究Nkx2-5基因在心肌分化和心脏发育中的作用奠定了基础。2真核表达质粒pEGFP-N1-Nkx2-5可在P19细胞中表达,可以用于真核细胞的转染和稳定筛选。3外源表达Nkx2-5基因的P19细胞不需诱导剂,只聚集培养即可向心肌细胞分化,诱导心肌标志物和横纹肌标志物的表达,且表达量随培养天数增加而逐渐增高。外源表达Nkx2-5基因可诱导P19细胞向心肌分化。4 5-aza诱导使单层培养的P19细胞向心肌分化,表达心肌早期转录因子和心肌特异基因,但是没有蛋白产物的表达。5 5-aza诱导使单层培养的外源表达Nkx2-5基因的P19细胞向心肌分化,在基因水平和蛋白水平表达心肌标志物和横纹肌标志物,且表达量随培养天数增加而逐渐增高。6在5-aza诱导单层培养时,外源表达Nkx2-5基因的P19细胞向心肌分化的情况优于未转染的P19细胞。说明Nkx2-5基因可以促进P19细胞单层培养时向心肌细胞的分化。