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温带地区野生动物的生殖现象多呈现季节性的变化,即生殖细胞和性腺的形态以年为单位呈周期性的变化,在一年中的某一特定时期达到其峰值。季节性繁殖是野生哺乳动物为了适应野外生存环境所进化出的一种特殊的繁殖方式,在温带野生哺乳动物中十分常见。野生达乌尔黄鼠是典型的温带地区野生哺乳动物,具有季节性繁殖和冬眠两大特征,再加上数量大、采样相对方便等优点,使其成为我们研究野生动物季节性繁殖以及冬眠机理不可多得的模型。
c-kit是一种原癌基因,它编码跨膜的酪氨酸蛋白激酶受体,该受体的配体是干细胞因子(stem cell factor,SCF)。SCF是一种重要的造血因子,SCF与c-kit受体结合对正常造血细胞、肥大细胞、黑色素细胞、生殖细胞的增殖和分化以及肿瘤细胞的增殖和恶性演进等都起着重要的调节作用。其中,在精子发生过程中,c-kit/SCF信号系统对胚胎期原始生殖细胞的迁移、增殖以及出生后的精子细胞的形成都有着重要的调节作用。
本项研究的目的是调查野生达乌尔黄鼠中精子发生是否存在着季节性变化,阐明c-kit/SCF信号系统在野生达乌尔黄鼠精子发生中的作用,并且揭示c-kit/SCF信号系统与精巢中类固醇激素合成的相互关系。2009年5月到9月于河北张家口坝上地区捕捉野生达乌尔黄鼠,取雄性达乌尔黄鼠的精巢组织,并测量精巢的重量和体积。组织学(histology)的方法观察野生达乌尔黄鼠精巢组织的q季节变化,在繁殖期(5月)可以观察到各种类型的生精细胞:精原细胞,初级精母细胞,次级精母细胞,精子细胞以及精子,但是在非繁殖期(7月)就仅仅可以观察到精原细胞和初级精母细胞,在冬眠前期(9月)可以观察到精原细胞,初级精母细胞以及次级精母细胞。通过免疫组织化学方法(immunohistochcmistry)检测了繁殖期,非繁殖期以及冬眠前期c-kit受体,SCF,卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)的受体以及细胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在野生达乌尔黄鼠精巢中的免疫定位;并且分别从繁殖期,非繁殖期以及冬眠前期的精巢组织中抽提总蛋白,应用免疫印迹手段(Western blotting)对繁殖期,非繁殖期以及冬眠前期精巢组织中c-kit受体,SCF以及PCNA的免疫活性进行了测定。免疫组织化学结果显示,在繁殖期和冬眠前期的精巢中,SCF和FSH的受体在支持细胞呈现较强的免疫阳性,c-kit受体以及PCNA在生殖细胞和间质细胞中内呈现较强免疫阳性,在非繁殖期的精巢中,观察不到SCF的免疫阳性,FSH的受体在支持细胞中的表达也很弱,c-kit受体和PCNA的免疫阳性较弱。免疫印迹结果显示,在繁殖期,c-kit受体,SCF,PCNA表达量较非繁殖期和冬眠前期的表达量大。同时,该研究还用免疫组织化学的方法测定了类固醇激素合成过程中的细胞色素P45017α羟化酶/c17-20裂解酶(cytochrome P45017α-hydroxylase/c17-201yase,P450c17),细胞色素P450侧链断裂酶(cytochrome P450side chain cleavage,P450scc),3β羟基类固醇脱氢酶(3β hydroxysteroid dehydrogenase,3βHSD)以及原癌基因c-fos,c-jun在不同时期野生达乌尔黄鼠精巢中的免疫活性。繁殖期P450c17,P450sce与3βHSD的免疫活性较非繁殖期和冬眠前期的免疫活性高;c-fos和c-jun在繁殖期的免疫活性比非繁殖期与冬眠前期的免疫活性高。研究结果表明在野生达乌尔黄鼠中c-kit/SCF系统免疫活性的变化与精子发生相互关联,c-kit/SCF信号系统在精子发生始动期起着重要的调节作用,c-kit/SCF信号系统可以作为季节性精子发生变化的一个标记物。另外,类固醇激素合成酶的表达的季节性变化与c-kit/SCF信号系统的季节性交化成正相关,提示SCF和c-kit受体之间的相互作用还可以调节类固醇激素酶的活性,从而增加睾酮的产生量,间接地调节野生达乌尔黄鼠精子发生。