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背景和目的哮喘是一种由多种因素引起的气道炎症性疾病,随着免疫学和分子生物学的飞速发展,过敏性哮喘的发病机制研究也取得了很大进展。据研究显示有多种免疫细胞、免疫分子等介质参与哮喘疾病的调节,这主要是因为哮喘患者气道处于高反应性状态,而且这种状态持续发生。早期人们传统认为Th1/Th2失衡和Ig E介导的变应原性致敏是导致哮喘的根本原因。大量医务科研工作者从免疫学角度对哮喘的机制进行深入研究,发现Treg细胞分泌的IL-10、IL-35与哮喘的发生有关,但具体的作用机制尚不完全清楚。CD4+CD25+Treg是最新发现的具有免疫抑制作用的调节性T细胞,是机体免疫调节中不可缺少的角色,主要靠分泌相关抑制性细胞因子发挥免疫抑制功能。Treg(CD4+CD25+T)与Teff(CD4+CD25-T)细胞在可溶性抗CD3抗体、抗CD28抗体联合作用下并相互亲密接触,才能使Treg细胞分泌相关抑制性因子。研究显示,Treg细胞发挥免疫抑制功能的细胞因子主要有IL-10、IL-35和TGF-β。Treg细胞分泌的IL-10是免疫抑制功能的重要成分,是与Treg密切相关发挥免疫抑制作用的细胞因子,但不是唯一的抑制性细胞因子。IL-35是近年来发现的介导Treg细胞免疫抑制功能的重要因子,它是IL-12家族的成员,由EBI3/IL-27β和IL12α/p35异源二聚体组成。它可以直接作用于效应T细胞发挥作用,能诱导初始T细胞产生新型的调节性T细胞-T35细胞(i TR35)。有研究显示,Treg和Teff在体外共同培养后,能上调EBI3和IL12αm RNA的表达量。这表明Teff和Treg共同培养下可能增强IL-35的分泌,猜测Teff与Treg混合培养可能增强Treg的免疫调节功能。TGF-β也是介导Treg细胞非常重要的免疫抑制性因子。这些免疫抑制性因子也可能是在过敏性哮喘中发挥免疫负调节作用的重要介质。方法:1.将SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为模型组和对照组,分别用OVA和生理盐水致敏和激发,建立哮喘模型和对照模型。2.解剖小鼠取出脾脏并充分研磨,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞。利用MACS(Magnetic Activated Cell Sorting)技术将脾脏单个核细胞分为Treg和Teff。3.用流式细胞仪检测分析所得的Treg和Teff的纯度。4.anti-CD3e包被96孔细胞培养板,添加磁珠分选Treg和Teff细胞并加入anti-CD28,在不同条件下,对Treg和Teff进行单独培养和混合培养,每种培养方式重复三个孔。5.在二氧化碳培养箱中培养48h后,收集上清用ELISA试剂盒检测不同培养方式下IL-10、IL-35的蛋白表达量。收集不同培养方式下所得细胞,提取细胞的总RNA,逆转录c DNA,以c DNA为模板,用荧光定量PCR检测IL-10、EBI3和p35基因的m RNA表达情况。6.应用SPSS 17.0统计分析软件对数据进行统计与分析;利用Graph Pad Prism 5制作统计图。结果:1.成功建立小鼠哮喘模型和对照模型。2.成功提取各个小鼠的单个核细胞并利用MACS技术成功分选出Treg(CD4+CD25+T)与Teff(CD4+CD25-T)细胞,分选出的Treg和Teff原代细胞纯度达80%左右。3.与对照组相比,六种培养方式IL-10、EBI3和P35的基因的相对表达量都有所下降,但无显著性差异(0.5<2-ΔΔCt<2)。Treg+Teff组和Treg+Teff+αCD3/CD28组的IL-10、EBI3和P35的基因表达量比其它四组明显下降,其中Treg+Teff+αCD3/CD28组的IL-10下降显著(2-ΔΔCt<0.5)。4.与对照组相比,不同培养方式的IL-10和IL-35的蛋白相对表达量都有下降,但无显著性差异(p>0.05)。结论:Treg细胞分泌的IL-10和IL-35可能和过敏性哮喘有着密切的关系,当其IL-10和IL-35表达量的降低可能在过敏性哮喘的病理过程起着主要作用。Teff和Treg的同时存在可能导致IL-10和IL-35的分泌量下降。通过Teff和Treg细胞调节IL-10和IL-35的表达或许是治疗过敏性哮喘的一个潜在的方向。