论文部分内容阅读
L-异亮氨酸作为人体八种必需氨基酸之一和三种支链氨基酸之一,由于它特殊的结构和功能在人体生命代谢中具有重要作用,它是合成激素、酶类等的原料,具有促进蛋白质合成并可以抑制其分解的作用。L-异亮氨酸已被广泛应用于食品工业、生物医药、化妆品、组织工程、光化学、电化学等领域。目前,L-异亮氨酸也已大量用于饲料添加剂以及添加到饮料中生产功能性饮料。本论文以一株可以在细胞外积累L-异亮氨酸的乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentation)作为生产菌株,以进一步提高L-异亮氨酸的产量、底物转化率和生产强度为目标,对L-异亮氨酸发酵过程进行了一系列优化。主要研究内容和结果如下：(1)采用DO-stat流加控制培养策略,研究了溶氧浓度20%、30%、35%和40%对B.lactofermentation分批发酵生产L-异亮氨酸的影响,结果表明溶氧浓度控制在20%时,L-异亮氨酸的产量较高,为24.3g/L,与对照相比提高了15.7%,但12.2%的糖酸转化率较分批发酵低。为提高细胞对葡萄糖的利用率,在DO-stat流加发酵的基础上,提出了快速补料分批发酵的策略,结果表明在36 h和52 h分别添加150 mL的新鲜培养基,发酵液中残留葡萄糖量下降,L-异亮氨酸产量为26.0g/L,比对照提高了7.0%,且糖酸转化率也有提高,为13.0%。在DO-stat流加发酵的基础上,考察了不同初始葡萄糖浓度对L-异亮氨酸合成的影响,在葡萄糖浓度80 g/L的条件下,细胞生长较快,糖耗也快,最先进入DO-stat流加控制培养,葡萄糖浓度140g/L的条件下最后进入流加阶段,最终L-异亮氨酸产量较高,为26.2g/L,但糖酸转化率较低,综合考虑,初始葡萄糖浓度还是选择100g/L。(2)研究了发酵中后期恒定不同葡萄糖浓度条件下L-异亮氨酸的合成情况,发现不同葡萄糖浓度对L-异亮氨酸的合成影响有明显差异,其中,葡萄糖浓度恒定在20 g/L时,L-异亮氨酸的产量较高,为26.8g/L。通过分析不同条件下L-异亮氨酸的比合成速率曲线,提出了分阶段控制葡萄糖浓度的策略,即采用24 h-48 h葡萄糖浓度控制在20g/L,48 h-68 h葡萄糖浓度控制在5.0 g/L的两阶段葡萄糖浓度控制策略,稳定期后细胞浓度比分批发酵有提高,大约42.5左右,L-异亮氨酸的产量较高,为31.6g/L,比葡萄糖浓度恒定在20g/L的水平提高了17.91%,糖酸转化率以及生产强度均有所提高,分别为13.8%和0.465g/(L·h)。(3)在摇瓶水平上考察了生物素、VB1、蛋氨酸以及柠檬酸钠4种物质对L-异亮氨酸产量的影响,影响顺序为蛋氨酸<VB1<生物素<柠檬酸钠,其中,柠檬酸钠浓度为4.0g/L时,对L-异亮氨酸的合成促进作用最明显,为11.4g/L,比对照提高了19.75%。并在3L发酵罐中进一步研究了添加4.0g/L柠檬酸钠对L-异亮氨酸发酵的影响,结果表明柠檬酸钠的添加对细胞生长影响不大,但溶解氧及葡萄糖的消耗速率均被减弱,L-异亮氨酸的合成速率在很大程度上得到提高,产量为27.1g/L,比对照提高了16.31%。最后应用代谢工程的方法,建立了B. lactofermentation合成L-异亮氨酸的代谢网络图,通过代谢流量分析手段,初步分析了添加柠檬酸钠对L-异亮氨酸代谢流量的影响。结果显示：添加4.0g/L柠檬酸钠后,EMP途径的流量减少了,而HMP途径的代谢流增加了,为L-异亮氨酸的合成提供了充足的还原力NADPH。