论文部分内容阅读
目的:炎症性肠病是一种慢性非特异性易复发的肠道炎症性疾病,其发病率不断上升,已成为包括亚洲在内的新兴工业化国家的全球性疾病,给社会和家庭造成了巨大的经济负担。电针治疗炎症性肠病疗效确定,具有操作简便、安全易行等特点,被广泛用于炎症性肠病的防治。本研究通过建立内脏炎症痛模型,筛选最佳造模的三硝基苯磺酸钠(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution,TNBS)剂量、确定治疗用穴以及电针治疗炎症性肠病的作用靶点,旨在探讨电针治疗炎症痛的外周免疫机制,为临床推广电针治疗内脏炎症痛这一新的治疗手段提供科学理论依据。本课题组前期研究表明,电针通过激活内源性大麻素受体抑制炎性因子的表达,从而发挥镇痛效应,故本研究以内源性大麻素受体作为电针治疗炎症性肠病的起效靶点,以期为电针治疗炎症性肠病提供理论依据,为临床应用提供实验依据。通过不同剂量梯度TNBS溶液+无水乙醇溶液建立炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)模型,比较各组疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分、结肠长度、推进率测定、结肠病理损伤的组织学评分和生存率等,筛选出建立炎症性肠病模型的最佳TNBS造模剂量。在穴位选择方面,采用伊文思兰(Evans Blue,EB)尾静脉注射,观察伊文思兰在大鼠体表渗出点,根据伊文思兰在体表的渗出点部位选择出敏化及非敏化穴位,并通过电针敏化穴和非敏化穴,比较Bristol评分(bristol stool scale,BSS)、机械痛阈、结肠病理损伤的组织学评分、推进率、结肠长度、HE染色以及大麻素Ⅰ型受体(Cannabinoid 1 receptor,CB1R)、大麻素受体Ⅱ型(Cannabinoid 2 receptor,CB2R)、乙酰胆碱转移酶(choline acetyltransferase,Ch AT)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、P物质(Substance P,SP)在结肠组织中的蛋白表达水平,以期为研究电针治疗IBD的机制及其选穴依据提供科学证据。方法:1.选用40只雄性SPF级C57BL/6(20-25g)小鼠,随机分为:溶媒对照组(溶媒对照组)、80mg/kg TNBS+无水乙醇组、100mg/kg TNBS+无水乙醇组、120mg/kg TNBS+无水乙醇组,每组10只。检测各组小鼠的DAI评分、结肠长度、推进率、HS评分以及生存率等行为学。2.实验A:选取10只成年雄性SPF级SD大鼠,随机分为溶媒对照组(5只)经肛门生理盐水灌肠,其余的大鼠进行TNBS溶液灌肠建立炎症性肠病模型。所有大鼠通过尾部注射伊文思兰,通过肉眼观测观察体表渗出点,经过统计分析,确定敏化和非敏化穴位。实验B:成年雄性40只SPF级CD57BL/6(20-25)g小鼠,随机分为:溶媒对照组、模型组、电针敏化穴组、电针非敏化穴组,每组10只。溶媒对照组及模型组只适度抓取,电针敏化穴组选取针刺敏化穴,电针非敏化穴组选取针刺非敏化穴,针刺后连接韩氏电针仪,电针刺激参数:1m A、2Hz、30min、疏密波,造模后第2天开始针刺,连续治疗7天。通过比较各组Bristol评分、结肠病理损伤的组织学评分、推进率、结肠长度以及CB1R、Ch AT在结肠组织中的蛋白表达水平,进一步验证电针调节炎症性肠病肠运动功能紊乱的治疗用穴。3.选取SPF级雄性C57BL/6(20-25g)小鼠共90只,实验A:40只小鼠按照随机数字表随机分为溶媒对照组、模型组、电针组、假电针组,每组各10只。比较各组DAI评分、机械痛阈、HS评分、结肠长度以及推进率、采用Western blot检测结肠组织CB1R、CB2R、IL-1β、SP的蛋白表达水平;免疫荧光组织化学方法检测结肠组织巨噬细胞与CB2R共表达、CB1R的表达情况;HE染色观察结肠组织形态结构。实验B:将50只C57BL/6雄性小鼠随机分为以下5组:溶媒对照组、模型组、电针组、电针+CB1R受体拮抗剂AM251组(EA+AM251)、电针+CB2受体拮抗剂AM630组(EA+AM630),每组10只。电针拮抗剂组于每天电针治疗前30min分别腹腔注射CB1R、CB2R拮抗剂,观察DAI评分、机械痛阈、HS评分、结肠长度、推进率以及Western blot检测IL-1β和SP蛋白表达水平。结果:1.不同剂量梯度TNBS对结肠炎小鼠DAI、HS、结肠长度、推进率、生存率的影响1)DAI评分情况:造模7天后,120mg/kg TNBS组>100mg/kg TNBS组>80mg/kg TNBS组>溶媒对照组;2)HS评分情况:造模7天后,100mg/kg TNBS组及120mg/kg TNBS组在造模后HS评分高于80mg/kg TNBS组,差异有统计学意义(P<0.05);与100mg/kg TNBS组相比,120mg/kg TNBS组差异无显著变化(P>0.05);3)结肠长度情况:造模7天后,120mg/kg TNBS<100mg/kg TNBS组<80mg/kg TNBS组<溶媒对照组;4)推进率情况:造模7天后,100mg/kg TNBS组及120mg/kg TNBS组在造模后推进率明显高于80mg/kg TNBS组(P<0.05);与100mg/kg TNBS组相比,120mg/kg TNBS组差异无统计学意义(P>0.05);5)溶媒对照组生存率优于80mg/kg TNBS组,80mg/kg TNBS组优于100mg/kg TNBS组,100mg/kg TNBS组优于120mg/kg TNBS组。2.EB渗出点与双侧穴位BL25有很高的相关性溶媒对照组体表伊文思兰渗出点很少,TNBS模型组诱导的IBD大鼠背部皮肤出现明显的EB渗出点,腹部肚脐周围可见少量EB渗出点,模型组EB在背部渗出点个数与对照组相比有显著差异(P<0.05)。IBD大鼠EB渗出点呈现神经源性节段性分布,并集中于T10-L6皮肤节段,且L4-6的渗出点比T10-12和L1-3节段显著增多(P<0.05),呈对称性分布。3.电针敏化穴对BSS评分、结肠长度、推进率、HS评分以及CB1R和Ch AT在结肠组织中蛋白表达水平的影响1)4组造模前BSS评分基础值(0d)没有统计学差异,具有可比性(P>0.05);模型组、电针敏化穴组、电针非敏化穴组的BSS评分指数造模后明显高于溶媒对照组(P<0.05);与模型组相比,电针敏化穴组在造模4天后(5d),BSS评分低于当天模型组的BSS评分(5d)(P<0.05);与电针敏化穴组相比,电针非敏化穴组在造模第4天后(5d)、造模第7天后(8d)BSS评分高于当天电针敏化穴组(P<0.05);2)与溶媒对照组比较,模型组、电针敏化穴组以及电针非敏化穴组的结肠长度和HS评分均有显著性差异(P<0.05);模型组与电针非敏化穴组的推进率有显著性差异(P<0.05),而电针敏化穴组的推进率与溶媒对照组比较无显著性差异(P>0.05);与模型组相比,电针敏化穴组的结肠长度、推进率以及HS评分值均有明显差异(P<0.05);与电针敏化穴组相比,电针非敏化穴组的结肠长度、推进率及HS评分均有显著性差异(P<0.05);3)与溶媒对照组相比,模型组的CB1R蛋白表达水平升高,但与溶媒对照组相比没有统计学差异(P>0.05),电针敏化穴组CB1R蛋白表达水平明显高于模型组(P<0.05),而电针非敏化穴组的CB1R蛋白表达水平与电针敏化穴组比较有显著性差异(P<0.05);与溶媒对照组相比,模型组的Ch AT蛋白表达水平明显升高(P<0.05);电针敏化穴组Ch AT蛋白表达水平明显低于模型组(P<0.05),而电针非敏化穴组的Ch AT蛋白表达水平与电针敏化穴组比较有显著性差异(P<0.05)。4.电针对DAI评分、机械痛阈值、结肠长度、推进率以及HS评分的影响1)与溶媒对照组比较,模型组、假电针组的HS评分、推进率以及结肠长度差异有统计学意义(P<0.05),电针组的HS评分、推进率与溶媒对照组比较无显著性差异(P>0.05);与模型组比较,电针组的HS评分、推进率、结肠长度以及假电针组的结肠长度差异有统计学意义(P<0.05),假电针组的HS评分、推进率无显著性差异,差异无统计学意义(P>0.05);与电针组比较,假电针组的HS评分、推进率以及结肠长度差异有统计学意义(P<0.05)。2)与溶媒对照组比较,模型组、电针组的DAI评分、机械痛阈有显著性改变,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,电针组造模后第三天直至实验结束DAI评分明显降低,机械痛阈显著升高(P<0.05),而假电针组的DAI评分与机械痛阈与模型组比较无显著性差异(P>0.05);与电针组比较,假电针组的DAI评分、机械痛阈无显著性差异(P>0.05)。3)与溶媒对照组比较,模型组CB1R、CB2R蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05);电针组CB1R、CB2R蛋白表达水平明显高于模型组(P<0.05),而假电针组的CB1R、CB2R蛋白表达水平与电针组比较有显著性差异(P<0.05);电针能显著降低结肠组织中Ch AT、IL-1β、SP蛋白表达水平,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05);而假电针组的Ch AT、IL-1β、SP蛋白表达水平与电针组比较有显著性差异(P<0.05)。4)与溶媒对照组相比,TNBS组、电针组及假电针组结肠组织中巨噬细胞单标细胞占视野面积的百分比显著增加(P<0.05),同时TNBS组、电针组及假电针组结肠组织中的CB2R单标细胞占视野面积的百分比显著增加(P<0.05,),而电针组的CB2R单标细胞占视野面积的百分比显著高于TNBS组和假电针组(P<0.05),同时,电针组CB2R和巨噬细胞双标细胞占巨噬细胞单标细胞面积的百分比也较溶媒对照组显著增加(P<0.05)。与溶媒对照组相比,模型组结肠组织中CB1R细胞占总细胞面积的百分比增加,但无明显差异(P>0.05);与模型组相比,电针组结肠组织中CB1R细胞占总细胞面积的百分比显著增加(P<0.05);与电针组相比,假电针组的结肠组织中CB1R细胞占总细胞面积的百分比显著减少(P<0.05)。模型组的结肠具有明显的病变结构,如脱落的上皮细胞、杯状细胞损失、炎症细胞浸润、隐窝消失或电针组表现出较少的上皮脱落,溃疡和白细胞浸润、肠肌层肌肉增厚。而电针组除了上皮炎性症状的缓解,从结肠隐窝的形式可观察到更好和更少的血管增生。5.大麻素受体拮抗剂对IBD模型小鼠HS评分、推进率、结肠长度、机械痛、DAI评分、Ch AT、SP以及IL-1β蛋白表达水平的影响1)与溶媒对照组比较,模型组、拮抗剂组的HS评分、推进率、结肠长度差异有统计学意义(P<0.05),电针组的推进率与溶媒对照组比较无显著性差异(P>0.05);与模型组比较,电针组的HS评分、推进率、结肠长度差异有统计学意义(P<0.05);与电针组比较,两组拮抗剂的HS评分、推进率以及结肠长度差异有统计学意义(P<0.05)。2)与溶媒对照组比较,模型组、电针组的DAI评分、机械痛阈有显著性改变(P<0.05);与模型组比较,电针组造模后第三天直至实验结束DAI评分明显降低,机械痛阈显著升高(P<0.05),而电针的镇痛作用可以被拮抗剂翻转,使DAI评分与机械痛阈与模型组比较无显著性差异(P>0.05)。3)与溶媒对照组比较,模型组结肠组织中Ch AT、SP、IL-1β的蛋白表达水平明显升高(P<0.05);而电针能显著降低IBD结肠组织中Ch AT、SP、IL-1β的蛋白表达水平(P<0.05);CB1、CB2受体拮抗剂能显著翻转电针对TNBS诱导IBD结肠组织中Ch AT、IL-1β、SP蛋白表达的抑制作用(P<0.05)。结论:1.根据DAI评分、结肠长度结果评测,120mg/kg TNBS组更优于100mg/kg TNBS组;根据推进率、HS评分以及生存率结果分析,两组均可选择,如果样本量大,考虑生存率问题,可以选择100mg/kg TNBS组;而本研究综合考虑以上因素,TNBS建立炎症性肠病模型时,选择剂量为100mg/kg TNBS;2.EB在炎症性肠病模型渗出点主要分布于背部,并靠近中线对称,该特点与背腧穴的分布高度相关。在大鼠背部的渗出区域与双侧“大肠俞”穴区具有高度相关性,极少EB渗出点分布于胸段。因此,结合《针灸学》针灸治疗泄泻取穴依据,我们选择了双侧“大肠俞”穴BL25作为敏化穴组的治疗穴位,由于渗出点在胸段皮节比较少,故将胸段的双侧“心俞”穴(BL15)作为非敏化穴组的治疗穴位。3.电针敏化穴能降低IBD小鼠大便性状评分、HS评分、推进率、结肠长度,从而来改善大肠肠运动功能紊乱调节机制,影响CB1R、Ch AT的蛋白表达水平。4.电针调节TNBS诱导的IBD小鼠HS评分、推进率、结肠长度、DAI评分、机械痛阈;促进IBD小鼠结肠组织中CB1R、CB2R的激活,抑制炎性因子IL-1β、致痛物质SP、Ch AT的表达,改善结肠运动功能紊乱和炎症反应,发挥镇痛作用。CB1、CB2受体拮抗剂能显著翻转电针对TNBS诱导IBD结肠组织中Ch AT、IL-1β、SP蛋白表达的抑制作用以及对IBD小鼠HS评分、推进率、结肠长度、DAI评分、机械痛阈的调节作用,表明CB1R、CB2R在IBD中能通过电针激活,并发挥镇痛和调节肠功能紊乱的作用。