论文部分内容阅读
单核细胞增多性李斯特氏菌（李氏杆菌）和小肠结肠炎耶尔森氏菌（耶氏菌）均是嗜冷性、人兽共患性、食源性致病菌。李氏杆菌可在0～40oC生长繁殖，通过污染食物而感染机体，致死率高达33%左右。耶氏菌在2～40oC范围均可生长繁殖，在0oC时可缓慢生长。这两种嗜冷致病菌在食品加工和冷藏过程中，对食物具有很强的污染能力，特别是对肉制品冷链生产处理过程更具危害性。目前，无论在发达国家还是发展中国家这两种菌危害都很广泛，是严重危害公共卫生安全的致病菌。因此，建立这两种菌快速的检测方法对保障食品卫生安全具有重要意义。本实验利用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，建立既可分别检测李氏杆菌和耶氏菌，又可同步联检的快速检测方法。LAMP方法操作简单、快速，且具有高特异性和高灵敏性，根据目的基因片段六个区域设计2对引物，即一对外引物（outer-primers，B3和F3）和一对内引物（inner-primers，BIP和FIP）。本实验以李氏杆菌hly基因和耶氏菌outL基因作为靶标基因，分别设计LAMP引物，以提取的李氏杆菌和耶氏菌基因组DNA（gDNA）作为检测模板，对反应体系内的Mg2+、三磷酸脱氧核甘酸（dNTPs）、甜菜碱、外内引物比、反应温度和时间等条件进行优化，分别建立李氏杆菌LAMP检测方法、耶氏菌LAMP检测方法、以及李氏杆菌耶氏菌同步联检LAMP方法。并通过人工污染肉样检测实验分析其在肉制品检样中的最低检测限。结果表明，李氏杆菌LAMP检测方法：总反应体系25μL，含有2.5μL10×thermpol reactionbuffe r、1μL Bst DNA polymerase（8U）、2μL gDNA、6mM Mg2+、1.8mM dNTPs、1M甜菜碱、0.2μM两个外引物（1:1）、1.0μM两个内引物（1:1）、65oC反应60min。李氏杆菌基因组最低检测限是77.5fg/μL，人工污染肉样菌落最低检测限是77CFU/mL。耶氏菌LAMP检测方法：总反应体系是25μL包括2.5μL10×thermpol reaction buffer、1μL Bst DNA polymerase（8U）、2μL gDNA、5mMMg2+、1.8mM dNTPs、1M甜菜碱、0.2μM两个外引物（1:1）、0.8μM两个内引物（1:1），63oC反应60min。耶氏菌基因组最低检测限是48.5fg/μL，人工污染肉样菌落最低检测限是80CFU/mL。李氏杆菌耶氏菌联检LAMP方法：总反应体系是25μL包括2.5μL10×thermpol reaction buffer、1μL Bst DNApolymerase（8U）、2μL gDNA、6mM Mg2+、1.8mM dNTPs、1M甜菜碱、0.2μM李氏杆菌和耶氏菌外引物（1:1）、1.0μM李氏杆菌内引物（1:1）、0.8μM耶氏菌内引物（1:1），65oC反应60min。李氏杆菌基因组最低检测限是82.4fg/μL，人工污染肉样菌落最低检测限是84CFU/mL；耶氏菌基因组最低检测限是56.7fg/μL，人工污染肉样菌落最低检测限是87CFU/mL；李氏杆菌和耶氏菌混合基因组（1:1）的检测限是69.4fg/mL，人工污染肉样菌落（1:1）最低检测限是94CFU/mL。结果显示，本研究建立的李氏杆菌和耶氏菌LAMP检测方法为保障肉品冷链生产食品卫生安全，进一步研制李氏杆菌和耶氏菌快检试剂盒奠定基础。