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单核细胞增多性李斯特氏菌(李氏杆菌)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(耶氏菌)均是嗜冷性、人兽共患性、食源性致病菌。李氏杆菌可在0~40oC生长繁殖,通过污染食物而感染机体,致死率高达33%左右。耶氏菌在2~40oC范围均可生长繁殖,在0oC时可缓慢生长。这两种嗜冷致病菌在食品加工和冷藏过程中,对食物具有很强的污染能力,特别是对肉制品冷链生产处理过程更具危害性。目前,无论在发达国家还是发展中国家这两种菌危害都很广泛,是严重危害公共卫生安全的致病菌。因此,建立这两种菌快速的检测方法对保障食品卫生安全具有重要意义。本实验利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,建立既可分别检测李氏杆菌和耶氏菌,又可同步联检的快速检测方法。LAMP方法操作简单、快速,且具有高特异性和高灵敏性,根据目的基因片段六个区域设计2对引物,即一对外引物(outer-primers,B3和F3)和一对内引物(inner-primers,BIP和FIP)。本实验以李氏杆菌hly基因和耶氏菌outL基因作为靶标基因,分别设计LAMP引物,以提取的李氏杆菌和耶氏菌基因组DNA(gDNA)作为检测模板,对反应体系内的Mg2+、三磷酸脱氧核甘酸(dNTPs)、甜菜碱、外内引物比、反应温度和时间等条件进行优化,分别建立李氏杆菌LAMP检测方法、耶氏菌LAMP检测方法、以及李氏杆菌耶氏菌同步联检LAMP方法。并通过人工污染肉样检测实验分析其在肉制品检样中的最低检测限。结果表明,李氏杆菌LAMP检测方法:总反应体系25μL,含有2.5μL10×thermpol reactionbuffe r、1μL Bst DNA polymerase(8U)、2μL gDNA、6mM Mg2+、1.8mM dNTPs、1M甜菜碱、0.2μM两个外引物(1:1)、1.0μM两个内引物(1:1)、65oC反应60min。李氏杆菌基因组最低检测限是77.5fg/μL,人工污染肉样菌落最低检测限是77CFU/mL。耶氏菌LAMP检测方法:总反应体系是25μL包括2.5μL10×thermpol reaction buffer、1μL Bst DNA polymerase(8U)、2μL gDNA、5mMMg2+、1.8mM dNTPs、1M甜菜碱、0.2μM两个外引物(1:1)、0.8μM两个内引物(1:1),63oC反应60min。耶氏菌基因组最低检测限是48.5fg/μL,人工污染肉样菌落最低检测限是80CFU/mL。李氏杆菌耶氏菌联检LAMP方法:总反应体系是25μL包括2.5μL10×thermpol reaction buffer、1μL Bst DNApolymerase(8U)、2μL gDNA、6mM Mg2+、1.8mM dNTPs、1M甜菜碱、0.2μM李氏杆菌和耶氏菌外引物(1:1)、1.0μM李氏杆菌内引物(1:1)、0.8μM耶氏菌内引物(1:1),65oC反应60min。李氏杆菌基因组最低检测限是82.4fg/μL,人工污染肉样菌落最低检测限是84CFU/mL;耶氏菌基因组最低检测限是56.7fg/μL,人工污染肉样菌落最低检测限是87CFU/mL;李氏杆菌和耶氏菌混合基因组(1:1)的检测限是69.4fg/mL,人工污染肉样菌落(1:1)最低检测限是94CFU/mL。结果显示,本研究建立的李氏杆菌和耶氏菌LAMP检测方法为保障肉品冷链生产食品卫生安全,进一步研制李氏杆菌和耶氏菌快检试剂盒奠定基础。