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目的:研究卵泡微环境中胶原盘状结构域受体2(Discoidin Domain Receptor 2,DDR2)在卵泡发育及排卵期的表达及作用,研究DDR2调控膜细胞、颗粒细胞功能的作用机制;阐明胶原通过激活卵泡体细胞上DDR2调控卵泡发育及排卵的作用及机制;揭示DDR2调控卵泡发育及排卵的作用与机制。为临床上一些不明原因的不孕症,提供新的理论依据。方法:(1)以出生后21天WT小鼠卵巢为研究对象,分别建立小鼠性成熟模型(7d、10d、14d、21d、25d、30d)、卵泡发育模型(P12、P24、P48)、排卵和黄体形成模型(H12、H20、H48、H72),应用免疫组化、间接免疫荧光等技术,在组织水平检测DDR2的表达定位;(2)以出生后21天SLIE小鼠卵巢为研究对象,WT小鼠卵巢为对照组,通过HE染色,检测DDR2对卵泡发育的影响;(3)进行小鼠颗粒细胞和膜细胞的原代培养,检测其增殖分化能力,并利用DDR2腺病毒以及对照病毒,感染SLIE小鼠卵巢颗粒细胞和膜细胞进行回复实验,检测其增殖能力是否得到改善;运用透射电镜,Western blotting以及qPCR技术,检测DDR2对细胞分化以及类固醇激素合成关键酶的影响。结果:(1)免疫组化结果显示DDR2在性成熟的小鼠卵巢整个阶段均有表达,主要集中在卵泡颗粒细胞、卵巢间质和卵泡膜细胞中,在卵母细胞中未见明显表达;在青春期前(Day 7、Day 10和Day14),DDR2在卵巢表面上皮部位有表达。在卵泡发育模型中,DDR2的表达也主要集中在P24阶段和P48阶段。在P24阶段,DDR2高表达于次级卵泡和窦前卵泡阶段;在P48阶段,卵泡主要呈窦卵泡,DDR2多表达在颗粒细胞。在排卵和黄体形成模型中,DDR2在黄体早期(H20)和发展期(H48)表达较高,随着黄体退化,DDR2的表达下降。随后,我们利用免疫荧光技术进一步定位表明:DDR2在颗粒细胞上的表达,主要定位在次级卵泡以后的卵泡发育阶段,并且和增殖密切相关。(2)WT小鼠和SLIE小鼠分别给予促排卵,HE染色对比发现,SLIE小鼠卵泡发育迟缓,卵丘复合物扩展缓慢,黄体形成障碍。在H8阶段,WT小鼠卵丘复合物完全扩展开,卵泡发育位于排卵前卵泡阶段,即将排除;而此时的SLIE小鼠卵母细胞仍热被紧密颗粒细胞紧紧包围;进一步的黄体形成中,我们可见WT小鼠卵巢内呈明显的黄体分布,而SLIE小鼠仍然呈大卵泡、甚至闭锁卵泡。(3)分别原代培养WT小鼠和SLIE小鼠卵巢颗粒细胞和膜细胞,用EDU掺入法,检测DDR2对卵泡体细胞增殖能力的影响,发现与对照组WT相比较,SLIE组颗粒细胞增殖能力下降(P=0.0035);膜细胞增殖能力也下降(P=0.0010)。当分别给予SLIE小鼠卵巢颗粒细胞和膜细胞Ad-DDR2腺病毒回复后,发现其增殖能力得到回复,与对照组Ad-EGFP相比较,P值分别为P=0.0107和P=0.0111。增值率提高10%左右。(4)透射电镜结果显示,黄素化后,WT颗粒细胞与SLIE颗粒细胞相比,细胞内管状线粒体明显增多,脂滴数量丰富;细胞质丰富,间隙连接完整;但是SLIE颗粒细和SLIE膜细胞均表现出明显的细胞相互之间连接疏松。免疫组化、western blot和qPCR结果表明,上皮细胞的marker分子E-cadherin在WT组表达下降,差异具有统计意义(P<0.05);间充质marker分子Vimentin之间的差异不是很明显。同时,类固醇激素合成酶3β-HSD、CYP11A1以及STAR等表达差异显著(P<0.05),具有统计学意义。(5)激素测定结果表明,在细胞水平测定上清里的激素和组织水平测定血清里的激素水平,WT组均大于SLIE组,差异显著,具有统计学意义(P<0.05)结论:(1)DDR2定位在卵巢间质,颗粒细胞层,膜细胞以及OSE部分,在卵母细胞中未见表达;(2)DDR2主要表达在次级卵泡及其以后的颗粒细胞上,且与增殖密切相关;(3)DDR2影响颗粒细胞和膜细胞的增殖和分化,其缺失导致卵泡发育迟缓,排卵和黄体形成障碍;(4)DDR2可能调控类固醇激素合成的关键酶3β-HSD、CYP11A1以及STAR,进而影响卵泡性激素的合成分泌,调控卵泡发育。