研究一 黄芪苷Ⅱ促进成骨细胞增殖和分化机制的研究背景:非创伤性股骨头坏死(Non-traumatic osteonecrosis of the femoral head,N-ONFH)是一种临床常见的骨代谢相关疾病。骨质疏松是一种常见的骨代谢疾病,以成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收之间的失衡为主要特征。股骨头灌注的研究发现骨质疏松患者股骨头灌注明显减少,更易发生N-ONFH。黄芪苷Ⅱ是中药黄芪的主要药理活性成分之一,已被证实在体外和体内参与骨代谢的调节,但是,其对成骨细胞骨形成的促进作用及其潜在机制尚未明确。目的:本研究的主要目的是阐明黄芪苷Ⅱ是否可以体外刺激成骨细胞的增殖及分化。同时,本研究还将探索黄芪苷Ⅱ调节MC3T3-E1细胞体外增殖、分化的潜在机制,明确介导其成骨活性的主要信号通路。方法:体外培养MC3T3-E1细胞,采用α-MEM培养基,补充10%胎牛血清,1%青霉素、链霉素,于5%二氧化碳,37℃培养。之后更换为分化培养基,然后将MC3T3-E1细胞分别用不同浓度的黄芪苷Ⅱ处理。药物处理结束后,收获细胞,按照相关试剂盒的说明书要求,对细胞增殖活性,ALP活性进行检测。此外,MC3T3-E1细胞按照上述方式处理,5天后按照TRIZOL试剂说明书对细胞总RNA进行提取,接着按照逆转录试剂盒要求将总RNA反转录生成cDNA。采用SYBR染料法,在ABI 9700荧光定量PCR上进行实时荧光定量PCR分析,考查药物对骨代谢相关基因mRNA表达的影响。最后,MC3T3-E1细胞按照上述方式处理,5天后采用RIPA缓冲液提取细胞总蛋白,并使用BCA方法对总蛋白进行定量,使用Western印记对相关蛋白表达水平进行分析。结果:首先,采用MTT法评估了不同浓度(0,5,10,20 μM)的黄芪苷Ⅱ对MC3T3-E1细胞体外增殖活性的影响。结果表明,与对照组相比,10和20μM的黄芪苷Ⅱ处理2天显著诱导了 MC3T3-E1细胞的增殖。用同样浓度的黄芪苷Ⅱ处理MC3T3-E1细胞3天或7天得到了类似的结果。此外,我们研究了黄芪苷Ⅱ对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响,结果表明,黄芪苷Ⅱ处理MC3T3-E1细胞3天小幅增加了 ALP活性,进一步延长处理时间至5到7天,发现黄芪苷Ⅱ能非常显著的增加MC3T3-E1细胞ALP活性。黄芪苷Ⅱ对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响呈剂量依赖性。为了进一步证实黄芪苷Ⅱ对MC3T3-E1细胞矿化结节是否有调节作用,本文使用茜红素S染色法对其进行了分析。结果显示,黄芪苷Ⅱ处理MC3T3-E1细胞21天显著促进MC3T3-E1细胞矿化结节的形成,与上述黄芪苷Ⅱ调节MC3T3-E1细胞ALP活性的结果非常一致。之后,我们研究了黄芪苷Ⅱ对MC3T3-E1细胞成骨分化相关基因mRNA表达水平的影响,结果显示,低浓度的黄芪苷Ⅱ即可诱导MC3T3-E1细胞Runx2和BGP基因的mRNA表达。高浓度的黄芪苷Ⅱ可非常显著的诱导Runx2和BGP基因mRNA表达增加2倍左右。最后,我们分析了 Runx2和BGP骨代谢相关信号通路,发现,Wnt/β-catenin信号通路抑制剂Dkk-1的使用反转了黄芪苷Ⅱ对MC3T3-E1细胞ALP活性的诱导作用,表明黄芪苷Ⅱ可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路从而调节骨代谢。结论:黄芪苷Ⅱ可以增加MC3T3-E1细胞增殖、诱导ALP活性、矿化结节形成、并促进其分化。黄芪苷Ⅱ对MC3T3-E1细胞增殖、分化的活性可能是通过Wnt/β-catenin信号通路来完成的。研究二 脂联素与N-ONFH的临床相关性研究背景:N-ONFH的发病率非常高,从年轻人到中老年人均可见发病。到目前为止,N-ONFH的详细发病机制尚未完全明了。由于其病理过程复杂,影响因素较多,对该病的早期诊断非常困难。很多患者被确诊为N-ONFH时就已经错过了最佳治疗时机。因此,寻找一个简单有效的对该疾病的早期诊断有帮助的生化指标是非常必要的。APN在人类表现出对骨量的负调节作用,可以作为骨量的独立预测因子。但是,APN与N-ONFH的相关性研究尚无报道。目的:该研究目的是探索N-ONFH病人脂联素水平与该疾病严重性之间的关系,为临床早期诊断及评估其严重程度和预防提供客观依据。方法:随机选取92个健康正常人群以及等样本量N-ONFH病人参与此项研究。采用酶联免疫吸附法检测所有样本血清中的APN水平。采用FICAT分期系统对N-ONFH患者的影响学进展进行评价。采用视觉模拟评分法(VAS),Harris髋关节评分法(Harris),西部Ontario及McMaster大学骨关节炎指数评分法(WOMAC)对N-ONFH病人临床症状严重性进行评估。结果:经独立样本t检验,与健康正常人群组相比较,N-ONFH组血清APN水平显著降低(t=10.896,P-0.000<0.05),差异有显著性。经单因素方差分析FICAT分期的三个组别之间差异有显著性(Welch=21.796,P=0.000<0.05)。通过Spearman相关性分析,血清APN水平与FICAT分期成显著负相关(r=-0.584,P=0.000<0.05)。经Pearson相关性分析,病人血清APN水平与VAS评分成显著负相关(r=-0.556,P=0.000<0.05),与 WOMAC 评分也成显著负相关(r=-0.310,P=0.003<0.05),与Harris 成显著正相关(r=0.404,P=0.000<0.05)。结论:APN水平与N-ONFH表现出高度相关性,并与该病严重性显著负相关,APN水平或可能作为潜在的预测N-ONFH发病倾向和评估N-ONFH严重程度的独立生化指标。研究三 促黑素与N-ONFH的临床相关性研究背景:据报道,作为一种来源于阿片黑素细胞皮质素原(POMC)的内源性神经肽,促黑素可以抑制炎症反应及阻止成骨细胞损伤。但是促黑素在N-ONFH中的作用尚不清楚。目的:本课题的目的是研究血清促黑素与N-ONFH的相关性。方法:本研究随机选取90个被诊断为N-ONFH的病人以及相同样本量健康正常人作为研究对象。采用酶联免疫吸附法对180个血清样本中促黑素水平进行测定。根据FICAT分期系统对N-ONFH病人影像学疾病进展进行评估。采用VAS评分法,Harris髋关节评分法,WOMAC评分法对N-ONFH疾病症状严重程度进行评估。作为潜在的生物标志物,血清APN、白细胞介素33(IL-33)也被相应的检测和分析。结果:经单因素方差分析,以FICAT分期划分的三个组别之间促黑素水平差异有显著性(Welch=11.820,P=0.000<0.05)。此外,通过Spearman相关性分析,血清促黑素水平与FICAT分期成显著负相关(r=-0.472,P=0.000<0.05)。经Pearson相关性分析,发现血清促黑素水平与VAS评分呈负相关(r=-0.497,P=0.000<0.05),与Harris评分呈现正相关(r=0.236,P=0.025<0.05),与WOMAC评分无显著相关性(r=-0.170,P= 0.108>0.05)。通过进一步比较血清促黑素、白介素33和脂联素之间的相关性,发现促黑素与白介素33成负相关(r=-0.312,P=0.003<0.05),而与脂联素成正相关(r=0.323,P=0.002<0.05)。在通过年龄及体重指数进行校正后,这些相关性仍然非常明显。二元logistic回归分析显示,APN、MSH是影响N-ONFH发病的独立因素(OR=0.327[0.217,0.492],0.298[0.206,0.431];P=0.000,0.000<0.05)。结论:血清脂联素、促黑素水平可能可以作为潜在的N-ONFH的保护性生化标志物。亦可作为预测N-ONFH发病的独立指标。研究四 黄芪苷Ⅱ对兔酒精性、激素性股骨头坏死模型脂联素、促黑素的影响背景:虽然脂联素、促黑素对非创伤性股骨头坏死具有保护性作用,但是缺乏发病前后的纵向观察比较。从体外研究可以看出,黄芪苷Ⅱ能够增加MC3T3-E1细胞增殖活性、诱导ALP活性、矿化结节形成、并促进其分化,但是缺乏相关动物实验研究支持。目的:本研究的主要目的是探讨脂联素、促黑素在中国白兔酒精性和激素性股骨头坏死发病前后的变化以及黄芪苷Ⅱ对脂联素、促黑素的影响,为脂联素、促黑素在临床诊断非创伤性股骨头坏死提供客观依据,亦为黄芪苷Ⅱ在临床的推广应用提供基础研究。方法:酒精造模组和激素造模组各随机选取48只中国白兔,随机分为三组:正常组、模型组和实验组,实验组是在模型组的基础上加入黄芪苷Ⅱ灌胃干预。在实验开始前和实验8周分别检测血清脂联素、促黑素水平,实验8周时,取实验白兔股骨头骨组织送病理检查,记录各组的空骨陷窝率。比较实验前后各组血清脂联素、促黑素变化及造模后各组空骨陷窝率差异。结果:各模型组和实验组均出现不同程度股骨头坏死。经过配对t检验,干预后模型组、实验组的APN、MSH显著低于干预前水平。(P=<0.05)经过单因素方差分析,干预后各组APN、MSH有显著差异(P=<0.05)。此外,酒精造模组、激素造模组各组间空骨陷窝率有显著差异(P=<0.05)。结论:脂联素、促黑素和兔酒精性和激素股骨头坏死发病密切相关,黄芪苷Ⅱ在改善骨坏死的同时,还可以提高酒精性和激素性股骨头坏死患兔促黑素水平,但对酒精性股骨头坏死患兔脂联素水平无影响。