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燃料乙醇是目前发展最快、应用最成熟的生物能源。纤维素原料来源广泛、价格低廉,有效转化纤维素原料还有利于农村经济,因此纤维素乙醇受到了国内外的广泛关注。但纤维素乙醇生产存在技术难题,主要是缺乏能在大量水解液抑制物存在情况下高效发酵葡萄糖和木糖的菌株以及相应的发酵工艺。本文选择了一株适合纤维素水解液发酵的克鲁维酵母进行纤维素乙醇新型发酵工艺的研究,并通过基因工程对原有木糖代谢途径进行改造,提高了乙醇产量并缩短了发酵时间。首先全面比较了纤维素乙醇菌株新秀Spathaspora passalidarum MYA-4345和本实验室选育的Kluyveromyces marxianus 1727-5的葡萄糖和戊糖发酵能力、耐高温能力及抑制物耐受能力。虽然S.passalidarum MYA-4345表现出较强的木糖发酵能力且乙醇产量较高,但K.marxianus 1727-5在葡萄糖和阿拉伯糖发酵方面优势明显,且在高温下仍能保持高效。K.marxianus 1727-5对乙酸和甲酸的耐受能力更强,甚至能够在15 g/L的乙酸浓度下生长。并且,K.marxianus 1727-5在使用未脱毒的玉米芯水解液进行同步糖化发酵中也表现出较强的发酵能力,故选择K.marxianus 1727-5作为后续实验研究菌株。根据K.marxianus 1727-5的发酵特性以及针对现有纤维素乙醇发酵工艺存在的问题,本研究结合底盘细胞特点,开发了一种新型发酵工艺——两步发酵法。第一步,纤维素物料经预处理之后直接进行发酵,采用微量通气策略消耗木糖,缓解葡萄糖对木糖的抑制,使木糖充分被利用;第二步添加纤维素酶进行同步糖化发酵。对发酵过程的通气量和纤维素酶添加时机和添加量进行了优化,得到的最优发酵条件是:发酵温度为40℃,通气量1.4 vvm,纤维素酶添加量10 FPU/g,添加时间为60 h。在最优的条件下,木糖醇得率为0.7 g/g,乙醇得率为0.41 g/g,发酵时间为96 h,证明了K.marxianus 1727-5和两步发酵法在纤维素乙醇发酵中的应用潜力。为进一步提高K.marxianus 1727-5木糖转化为乙醇的产量,对木糖代谢途径进行了基因工程改造,结果发现同时表达了XYL1.2、XDH和XK的重组菌株在木糖发酵速度和乙醇产量上均有提高,证明了XYL1.2、XDH和XK均对木糖代谢途径有促进作用。使用优化后的两步发酵工艺,木糖醇得率为0.8 g/g,乙醇得率为0.44 g/g,发酵时间90h,为目前酵母菌在此生产条件下使用未脱毒水解液发酵的最优结果。综上,本研究为纤维素乙醇生产提供了菌种支持和发酵工艺的参考。