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从土样中分离出一株胞外多糖产生菌株PS04,具有高产胞外多糖的能力。为了探明该菌的特征及多糖性质,本论文从该菌株的分类鉴定、胞外多糖的提取纯化、多糖结构和粘度性质的分析与鉴定以及该菌发酵PS04多糖的工艺条件优化几方面展开了研究,主要研究内容和结果如下:
(1)对PS04菌株进行分类鉴定,通过16SrDNA序列分析,结果表明,PS04菌株与GenBank登陆号为AY302439的Paenibacillus polymyxa WY110序列相似程度较高,达到98%以上,在系统发育树上处在同一分支,结合形态和生理生化鉴定,确定菌株PS04为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。
(2)采用95%乙醇、异丙醇、甲醇、丙酮等四种有机溶剂沉淀法提取PS04多糖,结果表明:丙酮、异丙醇、95%乙醇的提取效果较好,但三者差异不显著,故选择95%乙醇为最佳提取溶剂;对不同用量95%乙醇提取多糖效果进行比较,认为V乙醇:V发醇液为3:1与4:1时提取效果较好,本着节约成本的角度,确定溶剂比3:1为最佳溶剂用量。
(3)对PS04多糖粘度性质研究发现,该多糖溶液属于假塑性非牛顿型流体;其粘度性质与黄原胶相近,具有低浓度高黏性的特征,且粘度随浓度增加而升高;该多糖溶液对酸碱、温度稳定性好,对盐离子具有一定的耐受性。
(4)采用丙烯葡聚糖凝胶S-200HR对精制多糖进行过滤层析,得到单一组分峰:紫外扫描表明该多糖溶液在260nm与280nm波长处均无显著吸收峰,说明纯化过的PS04多糖不含蛋白质、核酸等杂质;采用凝胶渗透色谱法分析测定,可知PS04多糖重均分子量为4009KDa,峰位分子量为3174KDa,分布宽度指数为1.348;通过红外光谱分析,证明其为典型的多糖化合物;采用高效液相色谱法对其单糖组分进行鉴定,发现该多糖主要成分为果糖和葡萄糖,且比例为7:1;利用核磁共振技术对多糖结构分析发现,该多糖糖残基为呋喃型果糖,以β-2,6、β-2,1键连接。
(5)对PS04多糖进行发酵工艺研究,其单因素实验结果表明,摇瓶发酵最佳碳源为蔗糖,氮源为NH4NO3,温度为37℃、初始pH为6.0、接种量为4%、装液系数为0.4,Mg2+与Fe2+共同添加有利于多糖的合成,其中氮源、碳源及pH为影响PS04多糖发酵的主要因素;进一步采用响应面设计对发酵工艺进行优化,得到PS04多糖发酵的最佳工艺条件为:蔗糖浓度154.44g/L、NH4NO3浓度1.06g/L、初始pH值为8.22,在此条件下发酵48h,多糖产量可达到60.037g/L;采用5L发酵罐,以摇瓶发酵最优条件进行初步发酵放大试验,PS04多糖产量为55g/L左右。