目的:通过清热化湿祛瘀法对慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)湿热证患者的干预作用,观察中药清肾颗粒对患者血清中瘦素(Leptin)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法:依据随机数字表,将符合纳入标准的70例CRF湿热证患者分成治疗组和对照组,两组各35例,并设正常组30例(用于检测血清Leptin、MCP-1及ICAM-1)。研究过程中治疗组和对照组各剔除1例(其中因加服百令胶囊1例,因手术中途停药1例),最后实际完成68例,即治疗组34例,对照组34例。治疗组及对照组皆予以中药保留灌肠和西医基础治疗,治疗组另予清肾颗粒温水冲服,一日3次,一次1包(10g),疗程共持续12周。比较两组患者临床疾病疗效、中医证候疗效的差别,观察两组患者治疗前后中医证候积分值、血肌酐(serum creatinine,Scr)、估算肾小球滤过率(estimate glomerular filtration rate,eGFR)、Leptin、MCP-1及ICAM-1的变化情况。结果:1.两组患者临床疾病疗效比较:两组患者总有效率相比较差异有统计学意义(P<0.05),说明治疗组临床疾病疗效优于对照组。2.两组患者中医证候疗效比较:两组患者总有效率相比较差异有统计学意义(P<0.05),说明治疗组中医证候疗效优于对照组。3.两组患者治疗前后中医证候积分值比较:治疗前两组患者中医证候积分值差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,治疗组中医证候积分值较治疗前下降,差异有显著统计学意义(P<0.01),对照组中医证候积分值较治疗前下降,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后,治疗组中医证候积分较同期对照组差异有统计学意义(P<0.05)。4.两组患者治疗前后Scr、eGFR比较:治疗前两组患者的Scr以及eGFR水平相比较差异无统计学意义(P>0.05),治疗后治疗组Scr、eGFR水平相比治疗前差异有显著统计学意义(P<0.01),治疗后对照组Scr、eGFR水平相比治疗前差异无统计学意义(P>0.05),治疗后治疗组Scr、eGFR水平相比同期对照组差异有统计学意义(P<0.05)。5.治疗前后两组患者血清中Leptin、MCP-1、ICAM-1的水平比较:治疗前,与正常组比较,治疗组、对照组患者血清中Leptin、MCP-1、ICAM-1的水平均显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01);治疗前,治疗组与对照组患者血清中Leptin、MCP-1、ICAM-1的差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,治疗组与对照组患者血清中Leptin、MCP-1、ICAM-1的水平均较治疗前降低(P<0.05,P<0.01);治疗后,治疗组患者血清中Leptin、MCP-1、ICAM-1的水平较同期对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。6.安全性观察项目分析:治疗前后治疗组患者安全性指标如血常规、尿常规、粪常规、肝功能(ALT、AST)、心电图均未见明显变化。结论:1.CRF湿热证患者血清中Leptin水平明显升高,MCP-1、ICAM-1表达升高。2.清肾颗粒具有减轻CRF湿热证患者临床症状,改善肾功能的作用。3.清肾颗粒能降低CRF湿热证患者血清中Leptin、MCP-1、ICAM-1的水平。4.患者服用清肾颗粒后未见不良反应,于治疗前后检测安全性指标未见明显变化,可见该药有良好的安全性。目的:通过检测清肾颗粒含药血清低、中、高三个剂量组对瘦素诱导的人肾小管上皮细胞(Human renal tubular epithelial cells,HK-2)中瘦素(Leptin)、瘦素受体(OB-R)的含量以及转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β,TGF-β1)、肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor,HGF)、单核细胞趋化性蛋白-1(Monocytechemotatic protein-1,MCP-1)、细胞间粘附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)的表达情况;探讨HGF与TGF-β1之间表达的相互联系及清肾颗粒含药血清各剂量组是否能通过调节瘦素诱导的HK-2细胞中HGF与TGF-β1的表达,减轻HK-2细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),起到抑制肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)的作用。方法:选用健康日本雄性大耳白兔6只,体重2.5±0.2 kg,全部购自安徽医科大学实验动物中心,随机分为试验组和空白组,每组3只。试验组将清肾颗粒配成1.0g/ml药液,每只兔每次按5ml/kg灌胃,1次/d,连续10d。末次灌胃1h后,无麻醉状态下,注射器心脏采血,常温静置2h后,3000r/min离心10min,分离获得兔含药血清,混合均匀后,立即在超净工作台用一次性0.22μm微孔滤膜过滤除菌,56℃,30min水浴灭活,置-20℃保存备用。空白组予以等量生理盐水灌胃,并按照如上试验流程制备兔空白血清。HK-2细胞株全部购自中国典型培养物保藏中心细胞库(武汉),实验使用第2-3代细胞。选用同代细胞随机分为5组,包括空白对照组、瘦素组、清肾颗粒低、中、高剂量组。采用倒置相差显微镜观察细胞形态学改变;四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定各组细胞活性;RT-PCR法检测HK-2细胞中Leptin、OB-R、HGF、TGF-β1的m RNA表达情况;Western blot法检测HK-2细胞中Leptin、OB-R、HGF、TGF-β1的表达水平;免疫荧光法检测HK-2细胞中HGF、TGF-β1、MCP-1、ICAM-1的荧光表达情况;酶联免疫吸附法(ELSIA)检测HK-2细胞培养液上清液中Leptin、MCP-1、ICAM-1的表达情况。结果:1.MTT结果表明药物作用24小时后:与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组OD值均低于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组OD值均高于瘦素组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组OD值高于清肾颗粒中、高剂量组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。参照MTT结果最终选择药物作用时间为24小时。2.各组细胞中Leptin m RNA、OB-R m RNA、HGF m RNA、TGF-β1 m RNA表达情况比较(RT-PCR法)(1)Leptin m RNA表达情况比较:与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组Leptin蛋白表达均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组Leptin蛋白表达均低于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组Leptin蛋白表达低于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。(2)OB-R m RNA表达情况比较:与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组OB-R m RNA表达均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组OB-R m RNA表达均低于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组OB-R m RNA表达低于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。(3)HGF m RNA表达情况比较:与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组HGF m RNA表达均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组HGF m RNA表达均高于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组HGF m RNA表达高于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。(4)TGF-β1 m RNA表达情况比较:与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组TGF-β1 m RNA表达均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组TGF-β1 m RNA表达均低于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组TGF-β1 m RNA表达低于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。3.各组细胞中Leptin、OB-R、HGF、TGF-β1的表达情况比较(Western blot法):(1)Leptin表达情况比较:与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组Leptin表达均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组Leptin表达均低于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组Leptin表达低于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。(2)OB-R表达情况比较:与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组OB-R表达均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组OB-R表达均低于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组OB-R表达低于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。(3)HGF表达情况比较:与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组HGF表达均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组HGF表达均高于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组HGF表达高于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。(4)TGF-β1表达情况比较:与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组TGF-β1表达均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组TGF-β1表达均低于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组TGF-β1表达低于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。4.各组细胞中HGF、TGF-β1、MCP-1、ICAM-1的荧光表达情况比较(免疫荧光法):(1)HGF的荧光强度情况比较:HGF蛋白在荧光显微镜下可见绿光。与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组HGF的荧光强度均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组HGF的荧光强度均高于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组HGF的荧光强度高于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。(2)TGF-β1的荧光强度情况比较:TGF-β表达于细胞质,在荧光显微镜下呈红光。与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组TGF-β1的荧光强度均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组TGF-β1的荧光强度均低于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组TGF-β1的荧光强度低于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。(3)MCP-1的荧光强度情况比较:MCP-1在荧光显微镜下呈绿光。与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组荧光强度均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组荧光强度均低于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组Leptin的荧光强度低于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。(4)ICAM-1的荧光强度情况比较:ICAM-1的免疫荧光检测呈红光。与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组ICAM-1的荧光强度均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组ICAM-1的荧光强度均低于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组ICAM-1的荧光强度低于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中、高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。5.各组细胞培养液上清液中Leptin、MCP-1、ICAM-1的表达情况的比较(ELSIA法):(1)Leptin表达情况比较:与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组Leptin表达均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组Leptin表达均低于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组Leptin表达明显低于颗粒中、高剂量组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。(2)MCP-1表达情况比较:与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组MCP-1表达均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组MCP-1表达均低于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组MCP-1表达低于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。(3)ICAM-1表达情况比较:与空白对照组比较,瘦素组、清肾颗粒各组ICAM-1表达均高于空白对照组,差异均有显著统计学意义(P<0.01);与瘦素组比较,清肾颗粒各组ICAM-1表达均低于瘦素组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒低剂量组ICAM-1表达低于清肾颗粒中、高剂量组,且差异均有显著统计学意义(P<0.01);清肾颗粒中剂量组与高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.瘦素刺激HK-2细胞后可以诱导细胞发生EMT;2.清肾颗粒含药血清可以抑制瘦素诱导的HK-2细胞EMT进程的发展;3.HGF与TGF-β1具有相互拮抗的作用,瘦素可以通过某些信号通路使HK-2细胞中HGF与TGF-β1表达失衡,进而促进MCP-1与ICAM-1两种炎症因子的表达;4.清肾颗粒含药血清可以通过调节瘦素刺激的HK-2细胞中表达失衡的HGF与TGF-β1,减少瘦素诱导的HK-2细胞中Leptin、OB-R、MCP-1、ICAM-1等蛋白的表达,从而抑制细胞的EMT进程,延缓TIF的进展,最终起到减轻CRF的作用。5.清肾颗粒含药血清低剂量组对抑制瘦素诱导的HK-2细胞中HGF与TGF-β1的表达失衡,延缓TIF的进展,明显优于清肾颗粒含药血清中、高剂量组。