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背景红毛癣菌(Trichophyton rubrum,T.rubrum)在真菌感染中占很大比例,红毛癣菌所致皮肤癣菌病呈现为慢性迁延性、易复发、难治愈,通常侵袭人类浅表角质结构,但是免疫抑制、外伤等情况下,红毛癣菌能入侵深部组织结构,造成深部真菌感染。目前真菌感染的治疗药物由于副作用大、疗程长,病人依从性差等,治疗效果不理想,严重影响着病人的工作与生活。研究发现,皮肤中有对抗真菌感染的一系列免疫细胞,如朗格汉斯细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、角质形成细胞等。其中角质形成细胞(keratinocyte)能识别抗原、释放多种抗菌肽、调节分泌炎症因子,诱导炎症反应的发生,达到防御真菌感染的目的。作为皮肤的第一道防线,角质形成细胞表面有各种模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs),能识别红毛癣菌表面的细胞壁成分病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),诱导炎症细胞因子产生,启动进一步免疫应答。但是相比下,当角质形成细胞与真菌相互识别反应后,真菌本身会发生什么变化,真菌内部具体的反应机制尚未研究清楚。红毛癣菌细胞内大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)和一氧化氮(nitric oxide,NO)对细胞的生长和活性有一定的损伤作用,甚至导致真菌细胞死亡。在本研究中,我们主要探究当红毛癣菌侵袭角质形成细胞时,真菌内部的变化。我们将红毛癣菌与角质形成细胞混合培养,通过检测相关指标观察角质形成细胞对红毛癣菌生长是否有抑制作用,探讨ROS和NO对红毛癣菌的损伤作用。研究目的研究HaCaT细胞对T.rubrum生长的抑制作用并探讨其机制,为深入了解皮肤真菌与皮肤屏障之间的关系,进一步认识皮肤真菌感染的免疫机制起了重要作用。方法(1)在合适的条件下培养HaCaT细胞与红毛癣菌(ATCC4438),实验分组:T.rubrum,T.rubrum+HaCaT,分别进行选择合适的浓度比例及时间试验,确定合适的共孵育浓度比例与时间。(2)通过实验分组:T.rubrum,T.rubrum+HaCaT,T.rubrum+DPI(NADPH氧化酶抑制剂)+HaCaT,测定真菌活力、ROS、角蛋白酶含量,扫描电镜和透射电镜观察真菌形态变化。(3)通过实验分组:T.rubrum,T.rubrum+HaCaT,T.rubrum+L-NMMA(总NOS抑制剂)+HaCaT,测定真菌活力、NO、NOS及角蛋白酶含量,扫描电镜和透射电镜观察真菌形态变化。(4)通过实验分组:T.rubrum,T.rubrum+HaCaT,测定真菌ADMA表达。结果(1)检测真菌生长抑制百分数后,选定HaCaT细胞:T.rubrum合适浓度比例为4:1,HaCaT细胞与T.rubrum合适共孵育时间为24h,并用于后续实验。(2)与HaCaT细胞共孵育后,T.rubrum活力下降,真菌形态出现损伤,ROS水平增加,角蛋白酶活性降低,DPI能降低HaCaT细胞的抑制作用。(3)与HaCaT细胞共孵育后,T.rubrum活力下降,真菌形态出现损伤,ADMA表达下降,NOS、NO表达增多,角蛋白酶活性降低,L-NMMA能降低HaCaT细胞的抑制作用。结论(1)T.rubrum与HaCaT细胞共孵育后可能通过产生过量的ROS和NO,导致真菌的损伤,抑制了真菌的活力和侵袭力;(2)NADPH氧化酶和NOS可能是HaCaT细胞抑制T.rubrum生长的靶点;(3)为深入了解皮肤真菌与皮肤屏障之间的关系,进一步认识皮肤真菌感染的免疫机制提供理论基础。