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背景干细胞(stem cell)是一种具有多向分化潜能和自我复制功能的未分化细胞,在特定的条件下,可以分化为不同的功能细胞,形成多种组织和器官。按来源分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)的分化和增殖构成个体发育的基础;而成体干细胞(adult stem cell, AS)的进一步分化则是成体组织、器官修复再生的基础,具有来源广泛、可塑性强、无排斥反应等优势成为近年来研究的热点之一。脂肪干细胞(adipose derived stem cell, ADSC)是一种成体干细胞,具有向多种细胞分化的潜能,经过体外培养和体内接种可被诱导分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、肌肉细胞及心肌细胞等。由于脂肪干细胞具有取材容易、获得率高、对组织损伤小等优点,故在再生医学中占有重要的地位,并可为组织工程提高可靠的细胞来源,为临床应用奠定坚实的基础。目的本研究通过酶消化法分离培养脂肪干细胞,运用牙胚细胞条件培养液体外诱导脂肪干细胞向成牙本质样细胞分化,再将脂肪干细胞与成釉器上皮细胞混合接种入体内建立牙髓-牙本质复合体模型,证实大鼠脂肪干细胞的成牙潜能,为牙齿组织工程化研究获得大量、稳定、可靠的种子细胞提供理论和实验依据;并为体内、外成牙微环境的机理研究构建新的模型。材料和方法1.大鼠脂肪干细胞的培养、鉴定及定向诱导分化出生后4d SD仔鼠腹股沟处取得脂肪组织,酶消化法培养脂肪干细胞,免疫细胞化学法染色检测Vimentin、CD29、CD44、CK,为进一步研究其分化特性奠定了基础。将生长良好的ADSC培养于含β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松的矿化液中,检测碱性磷酸酶活性,免疫细胞化学法检测骨钙素和I型胶原的表达,Von Kossa染色检测矿化结节。2.体外诱导大鼠脂肪干细胞向成牙本质细胞分化将生长良好的ADSC与牙胚细胞条件培养液进行共培养,进行形态学观察,免疫细胞化学法检测牙本质涎蛋白(DSP)的表达,RT-PCR检测牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白1(DMP-1)的表达。3.体内诱导大鼠脂肪干细胞构建组织工程牙本质-牙髓复合体将标记后的ADSC分别与成釉器上皮细胞和聚醚酯弹性体(PTSG)材料混和后接种至大鼠肾被膜下,12周取材,进行组织学观察和免疫细胞化学检测。结果1.脂肪干细胞镜下形态为成纤维样,细胞群体倍增时间为42.2h,免疫细胞化学方法检测,抗Vimentin、CD29、CD44染色阳性,抗CK染色阴性,成骨诱导后细胞由成纤维样变为圆形或立方形外形,碱性磷酸酶升高,免疫细胞化学检测骨钙素和I型胶原表达阳性,出现矿化结节,表明ADSC已向成骨细胞转化。2.牙胚细胞条件培养液诱导后的ADSC变长,部分出现极性改变,免疫细胞化学方法检测胞浆DSP阳性,RT-PCR检测DSPP和DMP1阳性表达,表明ADSC已分化为有成牙本质细胞表型的细胞。3.体内移植物组织学检测显示牙尖样结构形成,成釉细胞、釉质、前期牙本质、成牙本质细胞由外向内平行排列,成牙本质细胞处于极化和分泌状态,DSP染色阳性,进一步说明了ADSC能被诱导分化为成牙本质细胞。结论:1.脂肪干细胞为多能干细胞,能在体外定向诱导分化为成骨细胞。2.牙胚细胞条件培养液能在体外诱导脂肪干细胞分化为具有成牙本质细胞表型的细胞。3.将脂肪干细胞与成釉细胞及支架材料复合在体内能成功构建牙髓-牙本质复合体模型。