随着原子能在国防、工业、农业、医疗、科技等国民经济各领域的普及应用,核能在巨大造福人类的同时,也给当今世界带来严重的核辐射危险,给人类的健康与安全带来了严峻的挑战。核武器的出现和使用给现代战争带来了更大的威胁,拥有核武器国家的增加及核武器的加速扩散增加了爆发局部战争的危险。我国也是核大国,拥有核武器、核潜艇等战略核力量,还有大量的核电站,因而核辐射防护在保障从业人员身体健康中具有重要的特殊地位,它在未来核战争、平时反核恐怖袭击,以及核电站事故应急救援中也具有重要的战略意义,加强核辐射损伤防护研究任重道远。现代生物医学的不断发展,放射治疗已经成为恶性肿瘤以及一些良性疾病的重要治疗手段,可是辐射对正常组织的损伤,限制了放疗的发展。降低辐射所造成正常组织细胞的损伤,给放射防护学家提出了新课题。探索高效、低毒的辐射防护剂始终是国内外放射防护研究的重点和难点。电离辐射对生物体构成的损伤,主要来自直接作用和间接作用,其中间接作用引起的损伤占辐射损伤的70%-80%左右,因此辐射防护剂的研究重点在于缓解或者清除辐射所产生的大量自由基,提高机体的抗放能力,从而保护机体组织和器官免受伤害。富勒烯及其衍生物在清除自由基,抗HIV病毒,保护缺血再灌注对人神经细胞、肺上皮细胞的损伤,以及保护紫外线对人角化细胞的损伤方面有很好的作用。但由于富勒烯水溶性很低,阻碍了其在生物学上的应用,解决富勒烯水溶性的方案主要有以下三种措施：①制备富勒烯水溶性包结物,如利用脂质体,环化糊精等将富勒烯分子包裹在亲水化合物中,此种方法虽然部分增加了富勒烯的水溶性,但是,在生物医学应用中仍严重受限,一是包裹富勒烯的效率较低,二是制备包结物的材料许多对细胞有毒性,三是操作程序复杂,很难应用于实际,所以其主要应用于无细胞体系的基础理论研究。②制备富勒烯水溶胶,这种方法制备的富勒烯水溶胶,富勒烯以团簇形式存在于水溶液中,制备过程中主要依靠强酸强碱的作用,制备的水溶胶中离子浓度很难控制,严重限制了其生物学应用,③在富勒烯碳笼上添加水溶性基团,合成制备富勒烯的水溶性衍生物。这种方法,一方面提高了富勒烯的水溶性,同时添加的水溶性基团可以保留部分其本身具有的活性,调整其衍生基团,可以降低甚至避免其毒性作用,可以用于细胞体系,乃至用于大体实验研究。目前通过添加水溶性基团以提高富勒烯水溶性的方法很多,有加羟基、羧基、氨基及磺胺基等,国内外报道及本实验室的研究发现,如加羟基的富勒醇和加羧基的C3等,基本保存了富勒烯强大的清除自由基的能力。同时表现出高效的抗氧化剂活性。有报道称对富勒烯赖氨酸类衍生物的合成及利用其光激发产生单线态氧研究其抗癌活性的研究,但鲜有其清除自由基能力的报道。本课题就是在此基础上,通过富勒烯与赖氨酸直接反应,生成一种水溶性很高的富勒烯衍生物C-lys,并对其表征进行初步鉴定。进一步研究该衍生物清除自由基的能力及其规律,评价它对正常细胞和肿瘤细胞的毒性作用,选出羧酸富勒烯C3的安全使用浓度,观察分析羧酸富勒烯C60-lys对γ射线照射后细胞存活率的变化和对细胞早期凋亡、细胞周期的影响,以及DNA的影响,初步阐明羧酸富勒烯C60-lys对细胞的辐射保护作用,为研制基于富勒烯为背景的新型辐射防护剂提供前期基础研究。研究内容：1.富勒烯赖氨酸衍生物的合成与结构确证：参考国内外有关文献,选择合成简单,水溶性较好,具备较好清除自由基能力的富勒烯赖氨酸衍生物C60-lys,摸索出较好的合成方案和技术方法。2.初步研究不同浓度C60-lys对AHH-1细胞和K562细胞的毒性作用,从中找出无毒性作用,或者几乎无影响,同时又具有很强自由基清除作用的合适浓度,为该化合物的应用前景提供一些实验依据。3.探索C60-lys对细胞的辐射生物学效应：选取几株成系细胞,作出细胞在不同照射剂量下的剂量存活曲线,将细胞与富勒烯赖氨酸衍生物C60-lys共孵育,分别观察：①不同浓度的富勒烯赖氨酸衍生物C60-lys对相同Y射线照射剂量照射后细胞的防护作用。②相同浓度的富勒烯赖氨酸衍生物C60-lys对不同照射剂量细胞的防护作用。③富勒烯赖氨酸衍生物C60-lys对不同细胞的辐射防护作用。④不同时间给药对细胞的辐射防护效果的影响。4.初步探索C60-lys对细胞株的防护效应机理：分析该化合物对细胞周期的影响,细胞DNA变化,8-0hdG浓度变化等。实验方法：1.富勒烯赖氨酸衍生物C60-lys合成：参考国内外有关文献,用本试验室已摸索出的化学合成平台,优化合成方法,合成制备C60-lys。2.细胞培养：AHH-1细胞为来源于人淋巴母细胞系的建株细胞(本实验室长期培养)。K562细胞为人红白血病白细胞本实验室长期培养)。细胞培养条件：RMPI-1640培养基Hyclone公司),10%NCSGIBCO公司),37℃,5%CO2,饱和湿气,在细胞培养箱中孵育。3.细胞Y射线照射：用钴-60γ射线照射不同剂量。4.C60-lys对细胞的毒性作用：使用CCK-8检测不同浓度C60-lys对正常细胞和肿瘤细胞的存活率,选取安全使用浓度。5.细胞存活率测定：用CCK-8检测不同处理细胞的存活率。细胞存活率(%)=(药物组OD值-本底/对照组OD值-本底)×100%6.细胞凋亡、细胞周期分析：用荧光染色法及Annexin V/PI双染,流式细胞仪检测凋亡百分率的变化,用PI单染分析细胞周期的变化。7.细胞8-0hdG浓度分析：通过8-0hdG Elisa试剂盒,检测不同浓度C60-lys照后细胞的8-0hdG浓度8.细胞DNA检测：照后各处理组细胞,通过单细胞凝胶电泳分析,荧光显微镜下观察其拖尾情况,拖尾越长,DNA损伤越严重。9.统计方法：数值以x±sd表示,组间差异用单因素方差分析。P<0.05为有差异统计学意义。实验结果：1.C60-lys合成和化学结构的分析：通过富勒烯与赖氨酸直接反应,再通过萃取、层析等方法进行初步提纯,。所生成的化合物通过氢谱、碳谱、红外光谱、元素分析等,初步分析其化学结构,得到目标化合物：富勒烯赖氨酸衍生物C60-lys。2.不同浓度C60-lys对细胞存活率的影响：不同浓度C60-lys分别与AHH-1和K562细胞共孵育48h,以CCk-8检测细胞存活率作为初步观察该化合物细胞毒性影响的指标。结果显示当C60-lys浓度小于1200mg/L时,AHH-1与K562细胞的存活率与对照组基本无差别。当浓度为1600mg/L时,AHH-1与K562细胞的存活率分别为80.4%和78.3%,明显低于对照组。(P<0.01)3.C6o-lys对AHH-1细胞的辐射生物学效应3.1不同浓度C60-lys对相同照射剂量对AHH-1细胞存活率的影响：分别用CCK-8和CASY细胞仪检测4Gy照射后24h,AHH-1细胞的存活率的变化。发现在0-800 mg/L范围内,随着药物浓度的增加细胞存活率上升,当药物浓度为800mg/L,CCK-8与CASY检测细胞存活率分别为86.5%和84.8%,相对于单纯照射组63.7%和61.3%,有显著的差异(P<0.05)。C60-lys与C3比较,在0-800 mg/L浓度范围内,给药组细胞照后存活率比单纯照射组细胞均有提高(P<0.05)；但两者相比,对照后细胞存活率相当,没有显著差异(P>0.05)3.2相同浓度C60-lys不同照射剂量对AHH-1细胞存活率的影响：给药浓度为800mg/L时,用CCK-8检测了不同照射剂量照射后24hAHH-1细胞的存活率,1、2、4、8Gy照后24h给药组与各单纯照射组AHH-1细胞均有不同程度下降,但各给药组细胞存活率均高于单纯照射组,照射剂量为8Gy时,给药组与单纯照射组细胞存活率分别为64.6%和41.3%。(P<0.01)。3.3C60-lys不同给药时间对AHH-1细胞存活率的影响：单纯照射4Gy后24h CCK-8检测AHH-1细胞存活率为55.1%,照前和照后不同时间给予800mg/L药物,给药组细胞存活率均有不同程度提高,尤以照前给药组提高明显,与单纯照射组细胞存活率相比有统计学意义(P<0.01)。照后给药虽略有上升,但没有统计学意义(P>0.05)。3.4不同浓度C60-lys对照后AHH-1细胞早期凋亡的影响：4Gy照射组AHH-1细胞Annexin V/PI双染检测的早期凋亡率为32.63%,给药100mg/L组凋亡率下降为24.86%,随着药物浓度的提高,早期凋亡率均有不同程度下降。药物浓度达到1200mg/L时,细胞凋亡率降到14.22%,与单纯照射组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。荧光染色法检测细胞凋亡,细胞凋亡率也随C60-lys浓度的增高而降低,当C60-lys浓度为1200mg/L时,凋亡率为16.3%,明显低于单纯照射组的39.2%,具有统计学意义,(P<0.05)。4.C60-lys对K562细胞的辐射生物学效应：4.1不同浓度C60-lys相同照射剂量对K562细胞存活率的影响：用CCK-8法检测24Gy照射剂量,照后24hK562细胞存活率。结果发现C60-lys浓度在0-800mg/L范围内,随着药物浓度的增加细胞存活率上升,药物浓度为800mg/L时,细胞存活率为74.3%,与单纯照射组(58.1%)相比有显著的差异(P<0.05)。4.2相同浓度C-lys不同照射剂量对K562细胞存活率的影响：CCK-8检测给药组和各对照组照后24h K562细胞存活率,给药组于各单纯照射组相比,细胞存活率均有明显上升(P<0.01)5.C60-lys细胞辐射生物学效应的机理探讨5.1 C60-lys对AHH-1细胞周期的影响：PI单染检测细胞周期,发现AHH-1细胞不同剂量的给药组与单纯照射组相比,G2/M细胞所占比例降低,存在明显差异(P<0.05)。5.2 C60-lys对受照AHH-1细胞8-OhdG的影响：通过8-OhdG试剂盒检测单纯照射组和各给药组照后8-0hdG浓度,反映照后细胞受损程度。结果发现,给药组AHH-1细胞照后8-OhdG浓度较单纯照射组有明显下降,且在C60-lys浓度为100-1200mg/L范围内,随着C6。-lys浓度的升高,8-OhdG含量依次下降(P<0.01)。5.3Ceo-lys对照后AHH-1细胞DNA的影响：通过中性单细胞凝胶电泳实验检测照后AHH-1细胞DNA双链断裂损伤情况,并利用CAPS-1软件分析。结果发现,正常细胞组在中性电泳中基本无拖尾显现,照射组与照射加药组均有一定程度的拖尾,但随着药物浓度的增加,细胞拖尾减少。(P<0.01)讨论与初步结论辐射对机体的损伤主要分为直接损伤和间接损伤,而辐射防护的重点主要是针对间接损伤,即通过清除辐射产生的自由基,减轻对机体的损伤。富勒烯是一种由60个碳原子组成的足球状物质,具有抗病毒、抗菌等生物学特性。另外,它还具有很强的清除自由基的功能,被称为“清除自由基的海绵”。但富勒烯为球状非极性物质,本身很难溶于水,这极大的影响了其生物学效应的发挥。目前解决富勒烯水溶性的主要手段是通过在富勒烯碳笼上添加水溶性基团,合成制备富勒烯的水溶性衍生物。C60-lys就是通过富勒烯与赖氨酸直接反应,在富勒烯碳球上添加赖氨酸基团的水溶性产物,并通过碳谱、氢谱及红外光谱等对化合物进行了确证。细胞生物学实验发现C60-lys对AHH-1细胞和K562细胞的毒性小,能提高照后两种细胞的存活率,并能降低AHH-1细胞的早期凋亡。而且照前给药对提高AHH-1细胞的存活率效果优于照后给药。我们进一步对C60-lys的辐射防护机制进行了初步研究,发现C60-lys能降低辐射引起的AHH-1细胞G2/M期比例,同时,照前给药能有效减少照后AHH-1细胞8-0hdG的含量并减少对DNA的损伤。