牛结核病(Bovinetuberculosis,bTB)是一种主要由牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)引起的人兽共患传染病。该病在全球范围内的流行，对公共卫生造成严重的影响，也使经济遭受重大损失。很多国家对牛结核的控制主要基于“检疫-扑杀”的防控策略。尽管全球大范围地对牛结核采取控制措施，但对其根除仍十分困难，某些官方宣布根除的国家依然检测到该病的存在。　　 鉴于分枝杆菌感染初期机体的免疫应答主要以细胞免疫为主，故对牛结核监测和预防控制主要是以细胞免疫应答(CMI)为基础的检测手段，包括结核菌素皮内变态试验(TST)和γ-干扰素(IFN-γ)检测试验。其中应用最普遍的检测方法是结核菌素皮内变态试验，但是其检测效果受限于敏感性和特异性。IFN-γ检测在很多国家被应用，该方法主要检测特异性抗原体外刺激全血后产生的IFN-γ水平。在实际应用中IFN-γ检测主要是作为结核菌素皮内变态试验的辅助检测手段。这两种方法使用的结核菌素纯化蛋白衍生物(purifiedproteinderivative，PPD)是由分枝杆菌培养物灭活提纯得到，成分比较复杂，作为检测抗原其特异性易受交叉反应影响。CFP10和ESAT6是结核分枝杆菌特异蛋白，其编码基因仅存在于致病性分枝杆菌中，禽结核、副结核等非致病分枝杆菌则不含有这两种基因，因此，这两种蛋白是良好的牛结核病诊断候选抗原。本研究应用毕赤酵母真核表达系统表达并初步纯化了CFP10-ESAT6蛋白，并对其在牛结核病检测中的应用进行了评价。　　 1.结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的真核表达和鉴定　　 PCR扩增获得cfp10-esat6融合基因，经筛选和测序鉴定正确后，克隆到pPICZαA表达载体，构建了重组质粒pPICZαA-(cfp10-esat6)，将其转入毕赤酵母菌GS115。重组菌经甲醇诱导，采用亲和层析的方法纯化酵母培养液上清，SDS-PAGE检测结果显示33KD的目的蛋白被成功分泌表达。Westernblot结果显示，CFP10-ESAT6融合蛋白可以分别与抗CFP10单抗和抗ESAT6单抗发生特异性反应，显示其具有较好的免疫反应性。经测定在最佳表达条件下酵母培养液上清中总蛋白量为25.2mg/L，采用亲和层析初步纯化后目的蛋白产量为18.3mg/L。　　 2.结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在牛结核病诊断中的初步应用　　 将毕赤酵母真核表达系统表达的CFP10-ESAT6融合蛋白和大肠杆菌原核表达系统表达的该蛋白分别用于皮内变态试验，检测阳性率低于同步进行的比较变态试验，说明应用结核分枝杆菌特异性蛋白CFP10-ESAT6的皮内变态试验结果的假阳性低于比较变态试验。将融合蛋白皮内变态试验结果与比较变态试验结果作比较，结果显示真核表达的CFP10-ESAT6融合蛋白皮内变态试验符合率(59.3％)高于原核表达的该蛋白(49.4％)，尤其是对于比较变态试验结果为阴性的个体，真核表达的CFP10-ESAT6融合蛋白皮内变态试验结果与之符合率(83.3％)显著高于原核表达的该蛋白(54.5％)，显示出较高的特异性。　　 在牛结核病低阳性率牛群的IFN-γELISA检测试验中，以CFP10-ESAT6融合蛋白作为刺激原的检测结果与PPD刺激的检测结果符合率较高(97.6％)。对于牛结核病高阳性率牛群，将CFP10-ESAT6融合蛋白作为刺激原进行牛结核IFN-γ检测试验，检测结果与PPD作为刺激原的IFN-γ检测结果相比较，以真核表达的CFP10-ESAT6融合蛋白为刺激原的IFN-γ检测结果符合率(83.7％)高于原核表达的该蛋白(78.9％)。对于受交叉反应影响的样品，以真核表达的CFP10-ESAT6融合蛋白作为刺激原的IFN-γ检测可以对其有效区分，从而实现牛结核早期感染的准确诊断。