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研究背景:外泌体(exosommes)最初发现于绵羊网织红细胞[1],是来源于细胞的粒径在30-100nm的膜性小泡,最初被认为是一种“细胞垃圾”[2]。近年来研究发现,外泌体中含有RNA和miRNA,并且能转导入受体细胞调节蛋白表达,证明外泌体不仅是一种细胞信息传递分子,更是一种遗传物质传递载体[3],是细胞间信息交流的枢纽[4]。研究发现,间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是产生外泌体能力最强的细胞,并且间充质干细胞外泌体(MSCs-exosomes)具有与MSCs相似的多种生物学功能[5-7]。有研究发现MSCs的旁分泌调节作用主要通过细胞分泌的外泌体来实现[8]。因此MSCs旁分泌调节作用的强弱与外泌体分泌量有直接关系。相关实验结论证实在炎症病理环境下MSCs外泌体分泌呈活跃状态[9]。有学者利用Y-干扰素模拟炎症环境,证实在此炎症环境下MSCs外泌体分泌量会增加[10]。CCL3是经LPS诱导后在巨噬细胞上清液中发现的相对分子量约为8000 kDa的两个肽链组成的细胞因子。多种细胞具有分泌CCL3的能力,其作用无种属特异性。其具有强大的趋化效应和炎症诱导作用。CCL3的受体有CCR1,CCR5和CCR9,均属于G蛋白偶联受体,CCL3与相应受体特异性结合后产生瀑布样细胞活化作用[11]。研究表明不同的炎症病理环境下均能检测到CCL3高表达[12-14]。同时有体外实验证明在骨髓衰竭型模型中通常能检测到CCL3的高浓度状态[15]。目的:通过体外模拟高浓度CCL3环境,来探讨炎症因子CCL3对人骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)外泌体分泌的调控作用。同时探讨CCL3在再生障碍性贫血(aplastic anemie,AA)发病机制中的作用。方法:本研究课题共分为3部分完成。第一部分—人BMSCs的分离培养和外泌体分离提纯:(1)在充分告知健康供者和AA患者本人并争得其同意后,签订知情同意书,从上述供者髂前上棘取出骨髓液1Oml。采用全骨髓贴壁培养法培养出人BMSCs;(2)将第5代人BMSCs培养并进行表面抗原鉴定及成脂、成骨诱导分化鉴定;(3)收集人BMSCsP3-P5代上清液提取外泌体(exosomes),透射电镜鉴定外泌体形态。第二部分—AA来源人BMSCs外泌体分泌功能探究:(1)用纳米颗粒跟踪分析技术(Nanosight,NTA)和流式细胞术来比较AA组和正常组外泌体的分泌量差异;(2)用流式细胞术鉴定AA来源人BMSCs细胞膜表面CCL3相关受体(CCR1,CCR5和CCR9)的表达情况以及比较正常组存在的差异。第三部分—细胞因子CCL3对人BMSCs外泌体分泌量的调节作用:(1)分别用CCK-8和活细胞计数法来检测CCL3对人BMSCs细胞增殖活性的影响;(2)用纳米颗粒跟踪分析技术(Nanosight,NTA)和流式细胞分析法来比较各组外泌体的分泌量差异检测;(3)用流式细胞术鉴定人BMSCs细胞膜表面CCL3相关受体(CCR1,CCR5和CCR9)的表达情况以及CCL3刺激作用后上述受体的表达情况变化。统计学方法:应用SPSS 20.0软件统计分析数据,计量资料均以(χ土 s)表示,两组间比较采用独立样本t检验分析,多组间比较采用单因素方差分析,当方差不齐时采用近似F检验Welch法;检验水准α =0.05,双侧检验。结果:第一部分:(1)经全骨髓贴壁培养法分离的人BMSCs,培养至第5代,细胞呈现成纤维细胞样贴壁生长。(2)流式细胞术结果提示细胞强阳性表达 CD73(100%)、CD90(99.5%)和 CD105(99.7%),弱阳性表达 CD34(0.2%)、CD45(0.1%)和CD19(0.1%),符合MSCs表型的标准。(3)细胞经成脂诱导到14天时可以发现细胞内大而圆的脂滴,证明细胞能分化为脂肪细胞。细胞经成骨诱导第21天后,可见大量红染的钙化结节,证明细胞能分化为骨细胞。第二部分:(1)AA患者BMSCs过度分泌CCL3。(2)AA患者BMSCs细胞膜表面不表达CCR1,但是CCR9表达量增加。(3)AA患者BMSCs外泌体的分泌量与健康供者BMSCs相比明显降低(P<0.05)。第三部分:(1)CCK8检测显示,CCL3组细胞存活率大于对照组(135.9%±6.4%vs 100%,P<0.05);活细胞计数结果显示,CCL3组细胞数明显高于对照组(8.08土0.48×105 vs 5.36±0.76×105,P<0.05);(2)细胞流式结果显示,BMSCs表达CCR1、CCR5和CCR9三种CCL3特异性受体。CCL3作用BMSCs后,CCR9荧光强度明显增强,CCR5和CCR1荧光强度无显著差异;(3)NTA结果显示,与对照组相比,CCL3组外泌体分泌量明显减小((5.00±0.06×1010)/mL vs(4.28±0.07×10100)/mL,P<0.05),同时微囊泡(粒径大于 100nm)数明显增多(P<0.05),CCL3作用浓度越大,外泌体分泌量越低;(4)外泌体流式结果提示,与对照组相比,CCL3组CD9+exosome阳性率显著下降(65.60%±2.10%vs 51.33%±5.42%,P<0.01)。结论:(1)CCL3促进BMSCs增殖但是却抑制其分泌外泌体,表现为一定的浓度依赖性;(2)CCL3使外泌体的平均粒径增大,同时促进无功能囊泡的形成;(3)AA患者来源BMSCs过度分泌CCL3,外泌体分泌能力低下,其细胞膜表面CCR9表达量增加,不表达CCR1。