唾液酸酶（sialidase/SD）是一种糖苷酶（glycosidase），功能是从糖蛋白和糖脂的非还原末端水解唾液酸（sialic acid）。人唾液酸酶主要分为三种类型，其中以人质膜型唾液酸酶（hmSD）较为重要。hmSD位于质膜，具有严格底物特异性，参与细胞的分化和信号转导，在细胞表面调节上发挥重要作用。很多研究提示hmSD的表达与肿瘤的发生密切相关，在肿瘤组织中，可见hmSD表达增高。因此，hmSD可能成为诊断与治疗肿瘤的新靶点。目的：构建人质膜型唾液酸酶（hmSD）真核表达载体，稳定转染前列腺癌PC-3细胞，获得稳定高表达hmSD的细胞株，探讨hmSD与细胞凋亡的相关性，为进一步研究hmSD与肿瘤的关系奠定基础。方法：1. 用RT-PCR方法从人睾丸组织中钓取hmSD基因，将其克隆至含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-C1，再转染至前列腺癌PC-3细胞中，利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）及唾液酸酶的活性测定进行鉴定。2. 稳定转染hmSD的PC-3细胞株经丁酸钠作用后，测定如下指标：（1）MTT测定丁酸钠对细胞的增殖抑制率；（2）流式细胞仪检测细胞凋亡峰。结果:1.以hmSD特异性引物进行PCR扩增后，电泳图谱显示在1.3kb处见到有一明亮且特异性很强的条带。2.pMD18-T-hmSD重组质粒经上海生工生物工程技术有限服务公司自动测序仪进行序列分析，证明所获得的cDNA片段与预期完全符合。3.用限制性内切酶（BglII和EcoRI）双酶切后，pMD18-T-hmSD重组质粒与pEGFP-C1-hmSD重组质粒上均可见约1.3kb的hmSD 特异性DNA片段。 <WP=47>4.利用脂质体法将重组质粒转染至PC-3细胞中，经Ｇ418筛选两周后，获得稳定转染pEGFP-C1与pEGFP-C1-hmSD质粒的PC-3细胞。荧光显微镜下可见绿色荧光，其中转染pEGFP-C1-hmSD质粒的细胞明显有膜聚集现象。5.分别测定正常PC-3细胞，转染pEGFP-C1载体的细胞和转染pEGFP-C1-hmSD质粒的细胞唾液酸酶活性，其中转染pEGFP-C1-hmSD质粒的细胞唾液酸酶活性比前两者增高（p<0.05），进一步说明转染成功。6.MTT法显示丁酸钠对PC-3细胞，pEGFP-C1细胞和pEGFP-C1-hmSD细胞具有不同程度的增殖抑制作用，其中，pEGFP-C1-hmSD的增殖抑制率低于前两者（p<0.05）。7.流式细胞仪检测发现，相同剂量丁酸钠对PC-3细胞，pEGFP-C1细胞,pEGFP-C1-hmSD细胞凋亡率影响不同，pEGFP-C1-hmSD的凋亡率低于前者（p<0.05），显示了hmSD明显的凋亡抵抗作用。讨论：一、hmSD cDNA 的获取由于hmSD的含量不高，因此选择合适的组织来保证RNA提取质量是相当重要的。鉴于hmSD的低峰度表达，需要增加PCR扩增数量，达到40次。这样目的片段的特异性成为难题。为了得到特异性较高的目的片段，我们①选择 gold taq 酶（Roche）,与普通Taq DNA聚合酶相比，该酶保真性很高，因此可以有效的防止碱基错配而使得PCR产物具有高度特异性，保证了hmSD蛋白的活性；②采取热启动（hot-start）PCR的方法，即在cDNA与引物混合后，95℃加热5分钟后再加入Taq酶，结果显示特异性较普通PCR方法为高。二、pEGFP-C1-hmSD 质粒构建鉴于测定唾液酸酶活性可间接检测其含量的方法比较成熟，因此本实<WP=48>验中选择具有直观性、即时性特点，带有绿色荧光蛋白标签的pEGFP-C1作为表达载体。由于GFP与hmSD位于同一个启动子之后，因此如果转染hmSD后的PC-3细胞在荧光显微镜下表现出绿色荧光，且有明显的膜性特征，说明已有GFP及hmSD二者的表达；且GFP分子量小，对hmSD空间构象无明显影响，从而保证hmSD的生物学活性（酶活性），所以进一步检测阳性重组细胞的唾液酸酶活性后，如其高于PC-3细胞组、假阳性组（表达载体中未重组唾液酸酶的转基因细胞），则可以判定已成功得到稳定表达融合蛋白质的细胞株。三、稳定高表达hmSD的前列腺癌PC-3细胞株的建立荧光显微镜观察，转染阳性的PC-3细胞可见绿色荧光，pEGFP-C1-hmSD的绿色荧光主要位于细胞膜处，定位清晰。通过唾液酸酶活性测定可证实，本实验成功构建了携带hmSD基因的重组质粒载体，获得稳定转染pEGFP-C1和pEGFP-C1-hmSD质粒的PC-3细胞，为进一步研究hmSD在前列腺癌细胞的侵袭力、转移力和与凋亡关系方面的作用奠定了基础。四、稳定转染hmSD的PC-3细胞对丁酸钠诱导凋亡的抵抗作用MTT和流式细胞仪的检测结果说明，在丁酸钠作用下细胞发生凋亡，而稳定转染hmSD的PC-3细胞凋亡率（S=2.7）比PC-3细胞的凋亡率（S=6.2）和转染pEGFP-C1的细胞凋亡率（5.8）低，可认为hmSD具有抵抗丁酸钠诱导细胞增殖抑制的特性。从转染hmSD基因的结肠癌细胞中丁酸钠诱导凋亡后，Bcl-2发生上调，可以推测，前列腺癌细胞中高表达的hmSD抑制细胞凋亡的机制可能是通过上调凋亡抑制基因Bcl-2发生的。但尚需深入研究。结论：1.利用RT-PCR技术成功的从人睾丸组织中扩增出hmSD的cDNA片<WP=49>段。2.将hmSD片段克隆入PMD18-T质粒中。经上海生工生物工程技术服务有限公司自动测序仪进行cDNA测定，测序结果表明，该cDNA确为hmSD。3.利用脂质体法将真核表达载体pEGFP-C1-hmSD和pEGFP-C1转染至PC-3细胞中，从而获得稳定表达hmSD的前列腺癌PC-3细胞，为后续实验奠定基础。4.hmSD对丁酸钠诱导的?