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第一部分白血病细胞NPM1突变蛋白与Akt蛋白的相互作用核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)突变是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中最常见的基因突变,基因突变导致NPM1蛋白异常的胞质聚集是该型白血病细胞最显著的生物学特征。PKB/Akt(Protein Kinase B)是参与细胞增殖、凋亡、分化、肿瘤迁徙转移和血管形成等一系列细胞生存相关进程的重要信号分子,而且临床上大约有一半的AML患者白血病细胞中存在Akt的组成性激活。前期研究中我们发现干扰白血病细胞中NPM1突变蛋白表达,Akt磷酸化水平随之下降,但其中的机制并不清楚。有文献报道野生的NPM1蛋白能与Akt的PH结构域相互结合,那么,突变的NPM1蛋白是否也能与Akt的PH结构域结合,参与调控Akt活性呢?本课题首先在天然携带NPM1基因突变的OCI-AML3白血病细胞中,采用双向免疫共沉淀实验观察内源性NPM1突变蛋白与Akt的相互作用。为了进一步确定Akt与NPM1突变蛋白相互作用的结构域,在293T细胞中共转染Flag-NPM1mA、HA-Akt或HA–Akt-△PH,免疫共沉淀检测外源性NPM1突变蛋白与Akt的相互作用。结果显示,OCI-AML3细胞中内源性NPM1突变蛋白可与Akt相互作用;293T细胞中外源性的NPM1突变蛋白与Akt相互结合,而PH结构域缺失的Akt不能与NPM1突变蛋白结合。提示白血病细胞中存在NPM1突变蛋白与Akt的相互结合,且结合部位在Akt的PH结构域。第二部分NPM1突变的白血病细胞中存在TRAF6介导的Akt泛素化激活Akt信号通路持续性激活与白血病的发生密切相关,而AML中大约70%的Akt组成性激活与白血病细胞胰岛素样生长因子1(insulin like growth factor-1,IGF-1)的自分泌有关。最近研究发现在IGF-1等生长因子作用下,肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF6)可以作为E3泛素连接酶使Akt分子发生K63位多聚泛素化修饰,泛素化的Akt分子随后移位到细胞膜,被PDK1和m TORC2磷酸化激活。为探讨白血病中是否存在TRAF6介导的Akt泛素化激活,Western blot检测白血病细胞株中TRAF6、p-Akt(T308)和p-Akt(S473)的表达水平;免疫共沉淀实验观察TRAF6与Akt的相互作用;Western blot检测干扰TRAF6表达后Akt磷酸化和泛素化水平的改变,以及干扰TRAF6表达对Akt细胞膜定位的影响。结果显示,六种白血病细胞株中存在TRAF6、p-Akt(S473)、p-Akt(T308)不同程度的表达;在OCI-AML3细胞中存在内源性TRAF6与Akt的相互作用,当采用IGF-1生长因子刺激时,两者相互作用增强;在OCI-AML3细胞中干扰TRAF6蛋白表达,可降低Akt的磷酸化水平、抑制Akt的泛素化水平,以及阻滞Akt分子在细胞膜的定位。提示NPM1突变白血病细胞中TRAF6能够介导Akt发生泛素化激活。第三部分NPM1突变蛋白作为“adaptor”促进泛素化Akt的细胞膜转位和磷酸化激活已知在IGF-1等生长因子作用下,TRAF6可以使Akt分子发生K63多聚泛素化修饰,随后泛素化的Akt移位到细胞膜上,进而被磷酸化激活。而抑制TRAF6蛋白表达或抑制Akt分子K63位泛素化后Akt的细胞膜定位明显减少。提示Akt的泛素化参与调控Akt的细胞膜转位过程。然而,Akt的泛素化调控Akt移位到细胞膜上的具体机制尚不清楚。有研究人员提出,Akt发生泛素化修饰以后,泛素化的Akt可能成为一个平台,招募胞质中的某些蛋白,而被招募的蛋白作为一个“adaptor”协助泛素化的Akt定位到细胞膜上。本课题第一部分已经证实,NPM1突变蛋白能够结合Akt分子,因此NPM1突变蛋白有可能作为一个“adaptor”协助泛素化的Akt定位到细胞膜上。为了探究NPM1突变蛋白在泛素化调控Akt细胞膜转位过程中的作用,首先在293T细胞中过表达NPM1突变质粒,Western blot检测Akt泛素化水平改变;干扰白血病OCI-AML3细胞中NPM1突变蛋白表达,Western blot检测Akt磷酸化水平和细胞膜定位改变;293T细胞中过表达NPM1突变质粒,Western blot检测Akt细胞膜定位的改变。结果显示,过表达NPM1突变对Akt的泛素化水平没有显著影响;干扰NPM1突变蛋白表达能抑制IGF-1诱导的Akt磷酸化激活,同时,还能减少Akt分子在细胞膜上的定位;在293T细胞中过表达NPM1突变能增强Akt分子的细胞膜转位。提示NPM1突变蛋白不影响Akt的泛素化水平,而是作为一种“adaptor”协同促进泛素化的Akt移位到细胞膜,进而增强Akt的磷酸化活性。