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核黄素反应性多种酰基辅酶A缺乏症(Riboflavin-responsive Multiple acyl-Co A dehydrogenation deficiency,RR-MADD)是由于缺乏ETF(electron transfer flavoprotein)和ETFDH(ETF dehydrogenase)而影响脂肪酸氧化、胆碱和氨基酸代谢,导致线粒体多种黄素蛋白脱氢酶功能障碍的一类常染色体隐性遗传性疾病。其主要临床表现为青少年或成年起病,以近端肢体进行性、运动不耐受的肌无力为著,部分患者伴有肌痛、恶心、呕吐、代谢性酸中毒等症状,肌电图主要是肌源性损害、神经源性损害或二者合并损害,大多数患者核黄素治疗能显著改善症状。病理显示脂滴异常沉积于骨骼肌肌纤维内,以I型肌纤维为主,电镜可见肌纤维内脂滴明显增多。我们所收集的53例RR-MADD患者主要和ETFDH基因突变相关,以c.250G>A(p.Ala84Thr)纯合突变和复合杂合突变为主,该位点突变频率为83.3%(80/96)。ETFDH突变导致的脂肪酸β-氧化障碍可能是RR-MADD患者的主要病因。血酰基肉碱和尿有机酸是临床上遗传性代谢病诊断的重要生物工具。酰基肉碱是参与人体内脂肪酸氧化的原料,串联质谱技术检测显示RR-MADD患者以中、长链酰基肉碱增高为主。各种有机酸是脂肪酸氧化的主要中间产物和终产物,气相色谱/质谱分析技术检测显示,RR-MADD患者以3-羟基丁酸、戊二酸、己二酸、乳酸、丙酮酸、乙基丙二酸、甲基琥珀酸等升高为主。我们发现大多数RR-MADD患者在疾病的急性期、稳定期及治疗前、后均存在血酰基肉碱和尿有机酸增高。本研究对53例RR-MADD患者进行基因检测,结合其临床特征分析,确定中国南方汉族人群RR-MADD患者的基因型与表型的关系。并检测其血酰基肉碱和尿有机酸,作为RR-MADD的辅助诊断工具,为核黄素治疗提供依据。方法如下:1.通过PCR、PCR-RFLP及测序技术,对收集的53例RR-MADD患者进行ETFDH基因突变进行检测和分型。2.通过ATP酶染色、ORO染色及HE染色确诊脂质沉积病。3.通过细胞免疫荧光技术检测体外培养的RR-MADD骨骼肌细胞和正常对照骨骼肌细胞中脂质沉积的情况。4.通过串联质谱法检测RR-MADD患者的血酰基肉碱水平,通过气相色谱/质谱分析法检测尿有机酸水平。5.通过细胞免疫化学技术鉴定细胞类型。结果:1.RR-MADD病症与ETFDH基因突变密切相关2.RR-MADD患者肌纤维细胞内的脂滴明显增多3.培养的原代骨骼肌细胞包括成肌细胞和成纤维细胞4.检测血酰基肉碱和尿有机酸可为RR-MADD患者提供诊断依据目前认为MADD主要由缺乏ETF(electron transfer flavoprotein)和ETFDH(ETF dehydrogenase)所致,具体致病原因为黄素蛋白酶进入线粒体呼吸链电子传递障碍,导致多种脱氢反应受阻。绝大多数RR-MADD患者的ETFDH基因存在突变,突变的ETFDH导致其蛋白表达降低,但是ETFDH基因突变是否使其蛋白在翻译后修饰上受到影响,具体机制仍然不明确。在前期实验中,我们课题组发现ETFDH蛋白受到泛素-蛋白酶体途径的调控,蛋白酶体抑制剂Epoxomicin可以使细胞内ETFDH蛋白得以稳定,同时增加ETFDH蛋白的多聚泛素化修饰,并可观察到突变型ETFDH的泛素化强于野生型。我们确定了CHIP为ETFDH蛋白的E3泛素化连接酶。CHIP和ETFDH在外源和内源条件下都互作。CHIP能够泛素化修饰ETFDH,过表达CHIP使ETFDH蛋白量降低,相反地,敲减CHIP可以使RR-MADD患者骨骼肌细胞中ETFDH蛋白量增加。综上所述,我们认为突变型ETFDH受到CHIP的修饰和降解作用强于野生型,导致突变型ETFDH蛋白稳定性下降。我们在细胞体外培养体系中额外补充核黄素,发现FAD 10 u M处理5小时可以使突变型ETFDH恢复到野生型的蛋白水平,证明FAD可以稳定突变型ETFDH蛋白。本研究阐释了ETFDH基因突变导致其蛋白水平下降的机制,为ETFDH基因突变的研究提供了新视角,有助于全面揭示RR-MADD的发病机制,为进一步的治疗提供科学基础和理论依据。方法:1.在293T细胞中共转野生型、突变型ETFDH和野生型、E3连接酶CHIP,通过Western blot技术检测ETFDH蛋白表达量的变化。2.采用免疫共沉淀技术检测CHIP与ETFDH蛋白的互作情况,以及ETFDH被CHIP泛素化修饰的情况。3.携带ETFDH shRNA的病毒感染骨骼肌细胞7-14天,用Western blot和细胞免疫荧光技术检测ETFDH抗体特异性。4.携带CHIP sh RNA的病毒感染骨骼肌细胞7-14天,用Western blot和细胞免疫荧光技术检测CHIP对ETFDH的降解情况。5.通过Western blot技术检测RFK和FADS在骨骼肌细胞的表达情况,检验FAD对ETFDH蛋白的稳定作用。结果:1.ETFDH抗体具有特异性2.突变的ETFDH在骨骼肌组织和培养的骨骼肌细胞中表达均低于野生型3.泛素化E3连接酶CHIP促进ETFDH蛋白降解,尤其是突变的ETFDH蛋白3.1 CHIP降解ETFDH蛋白依赖E3泛素化连接酶活性3.2 CHIP与ETFDH在蛋白水平上互作3.3 ETFDH蛋白可以被泛素化修饰3.4过表达的CHIP抑制了ETFDH蛋白水平,反之消减内源的CHIP可提高ETFDH蛋白水平4.FAD可以促进突变型ETFDH蛋白正确折叠并稳定其蛋白4.1 RFK和FADS在RR-MADD和正常对照的骨骼肌细胞中的表达无差异4.2 FAD可以稳定突变的ETFDH蛋白