ANK6是锚蛋白家族成员,通过其ankyrin锚重复序列介导蛋白相互作用。本实验室的前期研究发现,ANK6是调控植物受精过程中雌雄配子识别的关键成员。它在线粒体中通过与转录起始因子SIG5相互作用,控制植物中雌雄配子体识别的这一过程。ANK6不仅定位在线粒体,还定位在细胞核中。因此,进一步筛选与ANK6互作的蛋白,对于研究ANK6调控雌雄配子识别的分子机制,以及探讨ANK6在细胞核中的功能,都具有重要的意义。在前期工作中,运用酵母双杂交技术,以ANK6为“诱饵”,筛选拟南芥的cDNA文库,获得了一个新的与ANK6互作的蛋白序列,它是核糖体小亚基蛋白RPS16家族成员RPS16C的N端氨基酸残基序列。RPS16家族共有3个成员,分别被命名为RPS16A.RPS16B、 RPS16C。它们的基因序列以及蛋白序列的同源性很高。为了进一步证明RPS16与ANK6之间的相互作用,我们利用荧光双分子互补技术,证实RPS16家族成员的全长序列与ANK6在拟南芥细胞核中相互作用。而且,应用酵母双杂交技术,我们发现三个RPS16家族成员与ANK6相互作用的部位都在其N端(-71aa)。奇怪的是, RPS16成员全长蛋白在酵母系统中并不能与ANK6发生相互作用,这有可能是拟南芥的RPS16蛋白在酵母中不能正确折叠导致其N端功能区失活所致。通过GFP标签分别构建RPS16A/B/C的融合表达质粒,再分别转进拟南芥的原生质体,在荧光显微镜下观察到荧光信号都在细胞核中,表明RPS16家族的三个成员定位在拟南芥细胞的细胞核中。为进一步确定RPS16家族成员的亚细胞定位,我们还分别构建了RPS16家族单个成员带GFP标签的过表达转基因植株。在激光共聚焦显微镜下,观察到发出绿色荧光的部位能与通过细胞核核荧光染料DAPI染色的信号完全重合,证明了RPS16家族的三个蛋白都定位在拟南芥的细胞核中。应用带GUS标签的质粒,分别构建含RPS16家族成员启动子序列的融合表达质粒,获得转基因植株。对RPS16家族成员的启动子活性的研究发现,RPS16A与RPS16B在拟南芥的根、叶、花丝、花药以及柱头中有明显表达,而RPS16C则在拟南芥的根与叶中表达。RPS16家族成员中的RPS16A与RPS16B在拟南芥组织中的表达模式一致,而与RPS16C存在一些差异,暗示RPS16A与RPS16B在功能上存在冗余。RPS16家族各成员的T-DNA插入突变体及过表达植株,在正常和高盐、渗透等胁迫环境下,其表型与对照野生型拟南芥都没有明显差异,这也可能暗示着RPS16家族成员功能上的冗余。目前正在构建它们的双突变体以及三突变体。本研究对于阐明PRS16和ANK6的生物学功能有重要参考价值。