骨关节炎(osteoarthritis,OA)是一类最常见的关节疾病,多发于肩、膝、髋、肘、踝、脊柱等,其中膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)最为常见。据WHO预测,到2015年中国的OA患者将达1.5亿人,我国将成为世界OA患者最多的国家之一。由于年龄增长、肌肉萎缩和KOA引发的摔伤所致残疾甚至死亡在逐年上升,随着我国逐渐步入老龄化社会,KOA已成为影响我国老年人生活质量的重要公共健康问题。KOA临床表现为关节软骨退化、关节肿胀、僵硬、疼痛甚至功能丧失。目前KOA的治疗方法主要有手术、药物和辅助治疗。在KOA的早中期,临床一般采用药物和辅助治疗,缓解病人疼痛,改善关节功能。治疗KOA的药物可分为消炎药、止痛药、黏弹性补充剂等。1997年,美国FDA批准使用黏弹性补充剂来治疗KOA的症状。美国风湿病协会和欧洲风湿病防治联合会也认可黏弹性补充剂作为一种非手术治疗方法来减少疼痛并增强关节功能,治疗OA症状。目前常用的黏弹性补充剂为透明质酸(hyaluronic acid, HA)或交联HA,但其作用机制尚不明确,且易被体内的酶和自由基降解,半衰期短(研究报道最长为8.8天),患者需连续给药。因此,寻找一种与其功能类似,但更稳定、给药周期更长的新型黏弹性补充剂具有重要意义。黄原胶(xanthan gum, XG)为本课题组通过甘蓝黑腐病黄单胞菌经有氧发酵获得,具有水溶性、增稠性、悬浮性、稳定性和假塑性等许多优良特性。目前XG主要作为缓控释材料与非甾体类抗炎药制备口服用药用于治疗OA,未见注射剂剂型治疗OA,并且XG治疗OA的作用机制不清楚。本课题通过体内和体外研究,从分子、细胞和组织形态水平多层次研究XG注射液治疗KOA的疗效和作用机制,为以后该产品的临床研究和上市生产提供理论基础。1.注射用XG原料药的制备目的：制备注射级XG原料药。方法：菌种：甘蓝黑腐病黄单胞菌Xcc58；种子培养基：蔗糖2%,蛋白胨0.5%,酵母粉0.1%,pH=7;发酵培养基：玉米淀粉6%,豆饼粉0.25%, NaCl0.5%, MgSO40.25%, K2HPO40.25%,0.1%,pH=7.5；菌种经二次活化后,接种于发酵培养基,30℃,230r/min,培养72h。XG发酵后经过滤、除菌、醇沉、复溶、硅藻土吸附、活性炭吸附、微孔滤膜过滤、醇沉等步骤分离纯化后,真空干燥后粉碎。最后按照质量标准评价后得注射级原料药。结果：按照所示种子培养基、发酵培氧基和发酵条件获得的粗品XG再经分离纯化后可得注射级XGo XG分子量为3.384×106,产量为9.13g/L,质量符合注射级原料药评价标准。结论：通过实验确定注射级XG原料药的发酵条件,分离纯化工艺,所得XG符合要求。2.XG注射液治疗KOA的体内试验目的：建立KOA的体内模型,考察XG对该模型的疗效和作用机制。方法：新西兰兔行前后交叉韧带和半月板切除术后,将动物随机分为四组。以HA为阳性对照药,模型组注射生理盐水,从大体观察、组织学评价、mRNA和蛋白表达等方面评价2%XG注射1次、1%XG注射2次的疗效和作用机制。结果：手术后4周即成功建立OA动物模型。(1)给药13周后大体观察,与模型对照组相比,HA组和XG各剂量组右膝关节软骨和滑膜病变均有不同程度的减轻改善作用,关节大体评分显著降低,XG组与HA组无显著性差异。(2)组织学评价显示,与模型对照组相比,HA组和XG各剂量组Mankin’s评分均降低且有统计学差异,但HA组与XG各剂量组无显著性差异。与模型对照组相比,各给药治疗组的甲苯胺蓝染色消退有所减轻,提示对模型动物的软骨蛋白多糖(aggrecan)损耗具有一定的改善作用。(3)部分因子mRNA表达结果显示,与模型对照相比,XG及HA可显著增加TIMP-1、Ⅱ型胶原、aggrecan的mRNA表达,并且XG与HA之间无统计学差异。与模型对照相比,2%XG给药1次组及HA组可显著降低aggrecanase的mRNA表达,1%XG给药2次组的作用不明显。与模型对照相比,XG及HA可显著降低IL-1p的mRNA表达,作用强度为HA、1%XG给药2次>2%XG给药1次。与模型对照相比,XG及HA可显著降低MMP-1的mRNA表达,作用强度为1%XG给药2次>HA、2%XG给药1次。与模型对照相比,XG及HA可显著降低MMP-3、iNOS的mRNA表达,并且XG与HA之间无统计学差异。(4)部分因子蛋白表达结果显示,与空白对照组相比,模型组的iNOS和MMP-13蛋白表达显著增加,aggrecan表达显著减少。与模型组相比,XG可显著降低iNOS和MMP-13的表达,增强aggrecan的表达,XG与HA相比效果差异不显著。结论：兔膝关节腔注射XG后,在关节腔局部增加了滑液的黏弹性,成为了关节的润滑剂和缓冲垫。XG起到了润滑,缓冲的作用,为关节软骨和滑膜的自我修复提供了时间。这时,体内一些促软骨基质分解代谢的酶分泌减少,如iNOS,MMP-1、3、13, aggrecanase;促软骨基质合成的酶分泌增加,如aggrecan, TIMP等。这使得胞外基质如II型胶原和蛋白聚糖的降解减少、合成增加,保护了软骨细胞,软骨细胞凋亡减少,滑膜炎症得到缓解,促进关节局部的新陈代谢。最终,关节软骨的合成代谢大于分解代谢,软骨得到自我修复,缓解了KOA的发展。两组XG与HA相比,药效无显著性差异,XG给药可明显减少给药次数。3.XG注射液治疗KOA的体外试验目的：建立KOA的体外模型,考察不同剂量XG对该模型的疗效和作用机制。方法：新西兰兔处死,提取膝关节软骨细胞并进行培养。不同浓度XG作用于体外培养的兔膝关节软骨细胞,分别采用MTT法、活死细胞染色法和细胞周期检测法检测XG的细胞毒性和促增殖能力。10μg/mL LPS作用于体外培养的兔软骨细胞,建立KOA的体外模型。不同浓度XG (50、100、200μg/mL)作用于该模型,观察XG对LPS诱导的兔软骨细胞氧化损伤(ROS、NO、MDA、SOD)、炎性细胞因子(IL-1β、TNF-α、PGE2)、部分因子mRNA和蛋白表达的影响。结果：(1)胰蛋白酶和II型胶原酶消化后可成功获得兔原代软骨细胞,甲苯胺蓝可将细胞异染为紫红色。(2)与空白对照组相比,50、100、200μg/mL XG可促进软骨细胞增殖。与苯酚组相比,各剂量组XG对软骨细胞无毒性。(3)与空白对照组相比,不同浓度XG (50～200μg/mL)对兔软骨细胞细胞周期的影响无统计学意义。(4) DCFH-DA法检测ROS,与模型组相比,XG及HA均能降低LPS诱导软骨细胞表达ROS的量,XG及HA间无显著性差异,与Vc相比,XG及HA降低ROS水平的能力弱。(5)与模型组相比,XG、HA均能减少LPS诱导软骨细胞产生的NO, HA较为显著。XG、HA能显著降低LPS诱导产生的MDA,高剂量组XG优于HA。XG、HA能显著增强LPS诱导兔软骨细胞产生SOD的活性。(6)与模型组相比,XG、HA均能减少LPS诱导软骨细胞产生的IL-1β、TNF-α、PGE2。降低PGE2的作用强度为200μg/mL XG>100μg/mL XG、HA>50μg/mL XG。降低TNF-α的作用强度为100、200μg/mL XG>HA、50μg/mL XG。 XG各剂量组降低IL-1β的能力均弱于HA组。(7)部分因子mRNA表达结果显示：与LPS组相比,HA可显著增加TIMP-1的mRNA表达；XG对TIMP-1的mRNA表达,总体呈增加趋势,100μg/mL XG与HA之间有统计学差异。与LPS组相比,200μg/mL XG与100μg/mL HA可显著增加aggrecan的mRNA表达,XG与HA之间无统计学差异。与LPS组相比,XG及HA可显著增加II型胶原的mRNA表达；XG各剂量组之间无统计学差异,XG与HA之间也无统计学差异。与LPS组相比,XG及HA可显著降低aggrecanase、MMP-1的nRNA表达。XG各剂量组之间无统计学差异,XG与HA之间也无统计学差异。与LPS组相比,XG及HA可显著降低MMP-3的mRNA表达,其中50μg/mL XG的作用最强,随XG浓度升高,作用强度呈下降趋势,200μg/mL XG与HA之间有差异。与LPS组相比,XG及HA可显著降低IL-1p的mRNA表达,其中100μg/mLXG和HA的作用最强,50、200μg/mL XG与HA之间有差异。与LPS组相比,XG及HA可显著降低iNOS的mRNA表达,其中HA作用最强；50、100、200μg/mL XG与HA之间有差异,XG各剂量组之间无差异。(8)部分因子蛋白表达结果显示,与空白对照相比,LPS组可显著增加iNOS和MMP-13蛋白表达,降低aggrecan表达。与LPS组相比,XG和HA可显著增加aggrecan的表达并降低MMP-13表达,不同剂量XG无显著性差异,XG与HA相比差异不大。100和200μg/mL XG可显著降低iNOS的表达,且与HA有差异。结论：LPS刺激兔膝关节软骨细胞后,可产生大量ROS和NO,上调iNOS、MMP、IL-1β等的表达,产生大量炎性因子,增强了II型胶原和aggrecan等胞外基质的降解。本实验表明XG可抑制iNOS、MMP的表达,从而减少NO的产生,阻止胞外基质的降解,并能增强SOD的表达,从而清除氧自由基。这表明XG是一种安全、有效的软骨细胞保护剂。