研究背景：急性肺损伤（acute lung injury，ALI）具有很高的发病率，当其进一步加重则发展为急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），其致死率高达40%。研究发现，多种细胞与体液因素参与了ALI/ARDS的发生发展过程，但其具体机制目前尚不明确。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作为革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，在肺部感染和脓毒血症中起到重要作用，是ALI/ARDS的常见致病因素。由于ALI/ARDS居高不下的病死率，寻找其合适的治疗靶点就显得非常必要。蛇床子素（Osthol，Ost）是一类最先从伞形科植物中提取分离出的天然香豆素类化合物，其化学名称为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素，具有广泛的药理学治疗作用，近年发现其具有抗肿瘤、抗肝炎、抗骨质疏松、抗过敏及雌激素样作用，而且，进一步研究表明，蛇床子素可抑制炎症介质的释放。然而，目前尚不清楚蛇床子素是否对ALI有保护作用。近些年来，许多研究已报道了肾素-血管紧张素系统在重症急性肺损伤中的重要作用，其中血管紧张素转化酶2（Angiotensin converting enzyme2，ACE2）与血管紧张素转化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）作用相反，可下调血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）的表达，表明其是严重肺水肿和急性肺衰竭中关键的负性调节因子。因此，我们假设蛇床子素可能对急性肺损伤有保护作用，这种作用与ACE2的表达有关。本实验拟观察Ost对LPS所致小鼠急性肺损伤的保护作用，进而深入研究其可能的作用机制，为临床应用提供依据。实验目的：（1）观察蛇床子素对LPS导致的ALI的保护作用（2）观察蛇床子素是否通过抑制ACE2和Ang(1-7)表达的下调进而减轻LPS导致的ALI实验方法：动物实验为观察Ost对LPS导致动物死亡率的影响，成年雄性BALB/c小鼠（18~22g）采用腹腔注射脂多糖（50mg/kg）造成小鼠内毒素血症模型，并将其随机分为4组：对照组（n=20）、LPS组（n=20）、Ost20mg/kg+LPS组（n=20）及Ost40mg/kg+LPS组（n=20）。在Ost20mg/kg+LPS组和Ost40mg/kg+LPS组，LPS注射前给予连续四天的Ost（20或40mg/kg）灌胃。小鼠注射LPS后，每6小时记录一次小鼠的死亡情况，连续记录72h。成年雄性BALB/c小鼠（18~22g）随机分为4组，分别为：生理盐水（NS）对照组（n=12），Ost对照组（n=12），LPS组（n=12）及Ost+LPS组（n=12）。在LPS组，给予小鼠气管滴注LPS（5mg/kg）；NS组与Ost组，小鼠分别给予生理盐水或蛇床子素灌胃；在Ost+LPS组，LPS气管滴注前4天每天给予Ost灌胃（40mg/kg），最后一次灌胃后1小时给予LPS处理。在NS或LPS滴注后6小时取小鼠右肺进行病理观察，检测肺组织匀浆中血管紧张素转化酶2（ACE2）的mRNA及蛋白表达情况并检测血管紧张素1-7[Ang(1-7)]的浓度，免疫组织化学观察肺组织中ACE2与Ang(1-7)的表达情况，制备并测定小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中蛋白的含量、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白介素-6（IL-6）的表达水平，取小鼠左肺，测肺湿/干重比值（W/D）。细胞实验将大鼠肺泡巨噬细胞系NR8383细胞接种在96孔培养板（Ham’s F12培养基与15%胎牛血清），培养至一定数量后换成无血清培养基，给予ACE2抑制剂DX-600(100nM)的情况下用50μg/ml的Ost处理4小时，然后用LPS（1μg/ml）刺激细胞12小时，收取上清液测定TNF-α和IL-6的含量。实验结果：动物实验为评估蛇床子素对小鼠内毒素血症的保护作用，在LPS注射前每天给予小鼠蛇床子素灌胃（20或40mg/kg），连续4天，预处理高剂量的蛇床子素（40mg/kg）后，小鼠3天的死亡率为45%，与LPS组（75%）相比，其死亡率显著降低（P <0.05）；而低剂量蛇床子素（20mg/kg）预处理组小鼠3天死亡率（65%）与LPS组无明显差异（P=0.47）。以上数据表明Ost预处可明显降低内毒素血症小鼠的死亡率，且其效果有剂量依赖性。因此采用40mg/kg的蛇床子素进行下一步的实验研究。组织病理形态学研究发现，LPS组肺组织中充血与水肿明显增多并有大量的炎性细胞浸润，而预处理Ost后可使LPS所致的肺损伤明显减轻，肺组织结构接近正常；同时，LPS组小鼠左肺W/D、肺泡灌洗液中蛋白含量、TNF-α和IL-6的表达相比于对照组均与明的升高（P <0.05），但在Ost+LPS组上述指标显著降低（P <0.05）。在LPS组，小鼠肺组织匀浆中Ang(1-7)浓度为（142.4±5.905）ng/L，低于正常对照组（165.8±10.62）ng/L，而在Ost+LPS组升至（157.2±6.247）ng/L，与LPS组相比有统计学差异。LPS组小鼠肺组织匀浆中ACE2mRNA表达低于正常对照组（P <0.05）；而在Ost+LPS组其表达量升高，与LPS组相比有统计学差异（P <0.05）。Western blotting与免疫组织化学结果显示LPS能显著降低肺组织中ACE2和Ang(1-7)的含量；而在Ost预处理后，ACE2和Ang(1-7)的减少程度明显减轻。正常对照组与蛇床子素对照组之间无明显差异。细胞实验结果显示蛇床子素预处理可抑制LPS导致的细胞上清中TNF-a和IL-6含量的升高。但是加入ACE2抑制剂DX-600后，减弱了Osth抑制LPS导致的巨噬细胞细胞（NR8383）培养液上清中TNF-a和IL-6的升高作用。结论：（1）蛇床子素对LPS导致的小鼠急性肺损伤有保护作用。（2）蛇床子素可抑制LPS所致的NR8383细胞分泌的炎症因子增多。（3） LPS可导致小鼠急性肺损伤肺组织中ACE2表达的下降，而蛇床子素可通过抑制ACE2的降低来减轻炎症反应，进而发挥保护作用。