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第1章miR-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡及自噬的机制研究目的:本研究旨在探索miR-194-5p通过Stra8调控精子发生细胞凋亡与自噬的分子机制。方法:1.合成miR-194-5p前体基因序列,构建GV369-miR-194-5p慢病毒重组质粒。用HEK293T细胞包装获得的慢病毒感染睾丸畸胎瘤细胞(F9细胞),经嘌呤霉素筛选后,获得稳定过表达miR-194-5p的F9细胞株,流式细胞仪分析过表达细胞比例,qRT-PCR验证过表达后miR-194-5p的表达水平,qRT-PCR和Western Blot验证miR-194-5p过表达后Stra8的表达水平。2.利用流式细胞仪检测miR-194-5p过表达后细胞凋亡水平,分析前期RNA-Seq筛选出的Stra8基因敲除小鼠差异表达的细胞凋亡相关分子,qRT-PCR及Western Blot检测这些分子在miR-194-5p过表达F9细胞和Stra8 HOM小鼠模型中的表达趋势,揭示调控细胞凋亡的信号通路。3.MDC染色法检测miR-194-5p过表达后细胞自噬水平,qRT-PCR及Western Blot检测自噬相关分子在miR-194-5p过表达F9细胞和Stra8 HOM小鼠模型中的表达趋势。结果:1.序列测定结果显示:构建的GV369-miR-194-5p慢病毒重组质粒无突变且序列正确。利用HEK293T细胞成功包装出miR-194-5p慢病毒,感染F9细胞,筛选后得到稳定过表达miR-194-5p的F9细胞株。流式仪分析过表达细胞比例高;qRT-PCR和Western Blot结果显示,miR-194-5p F9细胞株中miR-194-5p表达水平升高,Stra8 mRNA和蛋白表达水平均降低。2.流式细胞仪检测结果显示,与对照组相比,miR-194-5p F9细胞的细胞凋亡率显著增加。与对照组F9细胞相比,miR-194-5p F9细胞中Bc12表达水平降低,而JNK、p-JNK、Bax、Bak、Cytochrome C、Caspase9 以及 Caspase3 表达水平升高。这种表达趋势在Stra8 HOM小鼠睾丸组织与WT小鼠睾丸组织的比较中也得到验证。3.MDC染色结果显示,与对照组F9细胞相比,miR-194-5p F9细胞自噬显著性增加。过表达miR-194-5p后,自噬底物分子P62表达降低,自噬相关分子Nrld1、Ulk1、Atg5、Vps18及自噬标记物LC3表达水平升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高。在Stra8 HOM小鼠睾丸中,与WT小鼠睾丸组织相比较,P62表达水平降低,LC3表达水平升高,LC3-Ⅱ/Ⅰ比值升高。这与miR-194-5p F9细胞中的趋势相一致。结论:miR-194-5p可能通过抑制Stra8表达进而通过JNK线粒体细胞凋亡信号通路促进F9细胞和生精细胞的细胞凋亡,可能通过抑制Stra8表达促进F9细胞和生精细胞的细胞自噬。第2章睾丸特异性蛋白Tex33在精子发生中的作用研究目的:本研究旨在研究Tex33的表达模式及其在精子发生中的作用。方法:1.Tex33多克隆抗体的制备与鉴定:PCR扩增Tex33基因ORF序列并构建pET-30a-Tex33原核表达重组质粒。IPTG诱导Tex33原核蛋白表达,利用Ni-NTA亲和层析柱纯化Tex33原核蛋白,经梯度尿素复性后免疫雄性新西兰大白兔,获得Tex33多克隆抗体。运用ELISA检测多克隆抗体的效价,Western Blot检测抗体的特异性及有效性。2.应用RT-PCR及Western Blot分析Tex33基因在小鼠多种组织中的表达模式;运用RT-PCR及Western Blot方法分析Tex33基因在精子发生不同发育时相中的表达模式;应用免疫荧光染色法分析Tex33蛋白在睾丸组织和精子中的细胞及亚细胞定位。3.运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建Tex33基因敲除小鼠;应用Western Blot及睾丸组织免疫荧光染色等方法进行基因敲除小鼠的鉴定。4.Tex33 HOM小鼠表型分析:观察并比较Tex33 HOM小鼠和WT小鼠睾丸、附睾形态及睾丸/体重比是否存在差异;应用H&E染色法分析Tex33 HOM小鼠睾丸的组织学结构;运用PAS染色法观察Tex33 HOM小鼠顶体发育过程;应用H&E染色法结合CASA仪分析Tex33 HOM小鼠精子质量;应用α-Tubulin免疫荧光染色法观察Tex33 HOM小鼠manchette微管形态结构;应用H&E染色法分析Tex33 HOM小鼠卵巢的组织结构;运用小鼠合笼实验分析Tex33 HOM小鼠的生育能力。结果:1.RT-PCR法成功扩增了 Tex33基因ORF序列,测序结果显示:构建的pET-30a-Tex33原核表达重组质粒序列完全正确。经IPTG诱导、纯化和复性后,成功获得了高纯度的Tex33原核蛋白。经4次重复免疫新西兰大白兔,获得了 Tex33多克隆抗体。ELISA检测发现多克隆抗体效价为1:1 00 0000。Western Blot结果显示:Tex33多克隆抗体能特异性识别睾丸组织和纯化的Tex33蛋白,其大小与预测的相一致。2.多组织RT-PCR分析发现,Tex33基因的三个剪接体均为睾丸组织特异性表达。Western Blot结果显示Tex33蛋白也仅在睾丸组织中表达。RT-PCR分析表明,Tex33基因的剪接体V2在小鼠出生后第21天开始微弱表达,第28天达到高峰,之后一直维持到成年。V1和V3从出生后第28天开始表达,直到成年维持在最高水平。Western Blot结果显示,Tex33蛋白表达开始于出生后第28天,持续高表达至成年。免疫荧光染色结果显示Tex33蛋白定位于精子细胞的顶体及manchette微管,在成熟精子中位于顶体及精子的尾部全长。3.运用CRISPR/Cas9技术靶向敲除Tex33基因的外显子2-4号,PCR法对Tex33基因敲除子代小鼠进行基因型鉴定。Western Blot及免疫荧光染色结果显示:Tex33 HOM小鼠睾丸内无Tex33蛋白表达,提示Tex33基因敲除小鼠构建成功。4.Tex33 HOM小鼠表型分析:Tex33 HOM小鼠和WT小鼠睾丸及附睾体积大小无显著性差异;Tex33 HOM小鼠的睾丸/体重比与WT小鼠相比无统计学差异;H&E染色结果显示Tex33 HOM小鼠睾丸组织结构与WT小鼠无显著差异,生精小管的直径及各级生精细胞排列均正常;PAS染色对精子发生时相进行分析,结果表明Tex33 HOM小鼠顶体发育过程无明显异常;精子涂片H&E染色发现Tex33 HOM小鼠的精子形态与WT小鼠相比无明显差异,应用CASA仪分析Tex33 HOM小鼠精子运动能力,结果显示,Tex33 HOM小鼠的精子数量、前向运动力和总运动力与WT小鼠相比无显著性差异;睾丸组织α-Tubulin免疫荧光染色,发现Tex33 HOM小鼠和WT小鼠manchette微管形态均正常;H&E染色结果显示Tex33 HOM小鼠和WT小鼠卵巢组织形态无明显差异;小鼠合笼实验结果显示Tex33 HOM雄性及雌性小鼠与WT小鼠相比平均每窝产仔率无统计学差异。结论:成功制备了特异性的高效Tex33多克隆抗体。Tex33是一种特异性表达于睾丸组织,具有高度遗传保守性的精子顶体及尾部基因,Tex33基因敲除并不影响小鼠精子发生过程,也不影响小鼠的生育能力,可能与其他基因共同调控精子形成过程,但其并非精子发生所必须。