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1．作者从山东疑似猪伪狂犬病发病猪场分离了一株病毒，并对其进行了全面鉴定。该分离毒株在兔肾原代细胞上（RK）上和鸡胚成纤维细胞（CEF）上连传5代均出现典型细胞病变，再接种RK-13细胞、BHK-21细胞、Vero细胞、PK-15细胞和143 TK-细胞均出现典型细胞病变，在RK-13细胞上的感染滴度为106.52TCID50／0.1mL；在电镜下可见到典型的伪狂犬病毒粒子；该分离毒对氯仿、乙醚敏感，56℃30min灭活；该分离毒能被伪狂犬病毒标准阳性血清中和；分离毒接种家兔、小白鼠和自然宿主猪均出现典型伪狂犬病症状与病变；提取所分离病毒的DNA为模板，应用特异性引物可以用PCR方法扩增出伪狂犬病毒gD基因中272-534nt之间262bp长的特异性片段。上述结果证明所分离病毒为猪伪狂犬病毒，将其命名为鲁A株（PRV LA Strain）。 2．对PRV“株gD基因进行了克隆和序列测定，表明其ORF为1203bp，可编码400个氨基酸组成的多肽，在整个gD基因的ORF内PRV LA株与PRV Ea株、Hubei株、Rice株，NIA-3株、Kaplan株以及BHV-5、EHV-1、FHV-1、CaHV-1、MDV、HVT、ILTV、HSV-1、HSV-2、SHBV的gD基因比较，核苷酸的同源性分别为98.3％、98.3％、98.0％、98.1％、98.6％以及45.7％、36.8％、36.7％、28.5％、28.4％、25.3％、32.4％、29.3％、31.8％、34.2％，氨基酸的同源性分别为97.8％、97.8％、97.5％、98.1％、98.6％以及34.5％、28.4％、31.8％、31.1％、26.9％、24.5％、19.4％、24.3％、24.7％、25.3％。 发现PRV LA株gD基因与Ea株、Hubei株、Rice株、NIA-3株、Kaplan株的gD基因均在802nt-837nt处有一个C（A）GGCCC重复高变区，其对应的是gD 267位-279位Arg-Pro的重复高变区。正是这一重复高变区的碱基缺失或插入使得PRVgD的ORF在1197nt-1215nt间变化，gD前体的氨基酸残基从398个-404个不等。 用DNAStar对PRV-LA、BHV-5、EHV-1、FHV-1、CaHV-1、MDV-1、HVT、ILTV、HSV-1、HSV-2，SHDV的SD氨基酸所做的进化树表明，它们可以被分成4个特定的组：单纯疱疹病毒组，水痘疱疹病毒组，类马立克氏病病毒组，传染性喉气管炎病毒组。其进化关系可能是单纯疱疹病毒组的gD是由水痘疱疹病毒组进化而来，水痘疱疹病毒组的gD又从类马立克氏病病毒组而来，后者又与ILTV的gD有共同起源，ILTV的gD有其独特的进化途径。因此。疱疹病毒的gD基因在进化上可能起源于ILTV的gD 表丛绿仁荧光士山和拙温汕贞D雍腆蛋山的＊K 刃组伪狂犬9山贞的构注基因的前体基国。 3．对 PRV LA株比基困进行了克隆和序歹。］jNI］定；表明其 ORF为 963hp，可编码 320个氨基酸组成勺多肽，在整个比 基因勺ORF 内 PRV LA株与 PRV NIA－3株、PRV Ea株、叩V洲株、状仁1、伐V6 比基因比较，核有酸白同源性分另为98．9％、99．5％、99．3＄、36．4％、39．1％，氨基酸的同源性分别为98．4％、99．7y、98．7y、36．6％、37．2％。PM M株比具有疙疹病毒胸菩激酶催化结构域的保守氨基酸共有序列和亚结构域特征序列。 前人研究证明痘苗病毒的比基因在进化上可能起源于宿主（鸡）细胞的w基因，而疤疹病毒比基因的起源一直未明。通过将叩VM孤、人和小鼠的胸替酸激酶、人脱氧胞旮激酶、人腺菩酸激酶的对应于这两个亚结构域的氨基酸用DN人S tar分析的进化树表明疙疹病毒的TK与人和小鼠的胸旮酸激酶的亲缘关系比与人脱氧胞喀淀激酶的亲缘关系更近，刚匕疤疹病毒的TK基因在进化上可能起源于宿主细胞的胸菩酸激酶基③。 4．提取PRV LA株基因组加A为盯R扩增模板，并根据Genbank己发表的 PRV Kaplan株叽 区UL25、UL24、UL23、UL22基因序歹J，选择保守序yi］设计了两对11物，这两对引物分别扩增出位于几23（比）两侧（含部分比基因）的可用于同源重组的左臂片段 （L）和右臂片段（R），L包括部分UL25、全部 UL24、部分比，R包括部分皿及部分UL22，L和R的拼接片段中比基因内部缺失 270个核菩酸。将L片段和R片段克隆于nBluescrint M 13－载体上，获得nSKLR；再将绿色荧光蛋白载体pEGFP－CI上含EGFP及其多克隆位点的完整的基固表达盒插入 PSKLR的 L片段和 R片段之间构成转移载体PSKLIG；又将猪瘟病毒 l．23Kb的 EZ（SFV—EZ）基因片段插入 PSKLRG的多克隆位点的 Bgl 11与 PStl之间获得转移载体 PSKLRGEZ。 5．提取 pSKLRG质粒，经单酶切线性化后用脂质体与 PRV Bartha－K61株共转染143T厂细胞，在细胞培养液中有5一涣脱氧尿喀啃旧rdU)存在的条件下筛选出表达绿色荧光蛋白的重组 PRV Bartha－K61毒株：PRV rBGFP。 6．提取PSKLRGEZ质粒；经单酶切线性｛匕后用脂质体与＊株叩V共转染BHK－21细胞，在细胞培养液中含有5’一浚脱氧尿喀喀（BrdU）存在的条件下，经筛选与纯｛乙获得 T A虫合表达 EGFP与 CSFVEZ 基因的重组病毒北 PRV rGEZ，并对其某些生物学特性进行了初步鉴定。 7．选门头 5周龄长大二元杂交猪分为 3组，第一组 3头，间隔 10天两次月几注PRVBartl。a－［61弱毒疫苗各1头份；第＝组6头，间隔10天两次OIL注重组病毒PRV rCEZ各1?