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CLE(CLAVATA3/ENDOSPERM SURROUNDING REGION)基因家族编码的多肽,作为一种植物激素,通过配体-受体信号途径在调节植物分生组织的细胞分裂和分化中起着重要作用。已有的研究证实,CLE家族基因控制植物根、茎、花等器官的生长发育和分生组织干细胞的分裂分化。拟南芥中的32个CLE基因,除了CLV3,CLE8,CLE40,CLE41和CLE45等少数几个,大多数的CLE基因功能依然未知。本研究采用反向遗传学方法,对获得的两个拟南芥CLE14基因的T-DNA插入突变体进行表型观察和分析,结合基因的表达模式分析,基因的过表达和互补实验,对拟南芥CLE14基因的功能进行了研究,同时利用TALEN技术创制基因敲除的cle14突变体,对CLE14的功能研究作进一步的补充和完善。主要研究结果如下:(1)通过RT-PCR和qRT-PCR分析了CLE14基因在幼叶、成熟叶片、早衰叶片和晚衰叶片中的表达水平,结果表明CLE14在未衰老和衰老初期的叶片中表达量很低,在叶片衰老晚期表达量急剧增加,分别比成熟时期和早衰时期提高了7.1和4.1倍;通过GUS组织化学染色实验,发现CLE14基因在叶片的衰老部位,特别是衰老程度较高的部位表达更为活跃。CLE14的表达模式分析实验表明拟南芥CLE14,在叶片的衰老过程中其表达上调,可能参与叶片衰老的调控。(2)通过PCR鉴定获得的两个CLE14的T-DNA插入纯合突变株系,莲座叶都比野生型更早地变黄衰老,而T-DNA插入位置更靠近编码区的cle14-c株系的这种表型更为明显。RT-PCR实验显示,两个cle14突变体株系中的CLE14并非完全被敲除,都还存在少量的表达。对cle14-c突变体和野生型莲座叶进行叶绿素含量、Fv/Fm、离子渗漏等指标的测定。数据显示,突变体叶片叶绿素含量平均为0.336mg/g,显著低于野生型的0.543 mg/g;在同一叶位,cle14突变体的Fv/Fm总体上都低于野生型,而离子渗漏率总体上都高于野生型,中部叶的差异更为显著。以上实验表明,拟南芥CLE14的缺失会造成叶片的提前衰老。(3)通过对CLE14过表达的转基因植株进行表型观察,发现过表达植株的叶片比野生型更晚变黄衰老。对CLE14过表达和野生型莲座叶进行叶绿素含量、Fv/Fm、离子渗漏等指标的测定,数据显示,过表达植株叶片的叶绿素含量平均为0.743mg/g,显著高于野生型的0.568 mg/g;在同一叶位,过表达植株的Fv/Fm总体上都高于野生型,而离子渗漏率总体上都低于野生型。使用CLE14多肽处理离体拟南芥叶片,与CLE14过表达的表型类似,叶片的衰老得到了一定程度的延缓。以上实验表明,拟南芥CLE14的过量表达,会推迟叶片的衰老。(4)将构建的以CLE14自身启动子启动基因表达的载体ProCLE14::CLE14,转入cle14突变体进行互补实验,发现转入CLE14后,cle14突变体的早衰表型恢复到了正常的野生型表型。互补实验表明,cle14突变体中CLE14的表达缺失是造成叶片早衰表型的唯一因素。(5)构建了针对CLE14进行基因敲除的TALEN质粒对,并将其成功的连接到亚克隆载体上,获得了TALEN植物表达载体。对转基因阳性苗进行基因突变检测,发现部分样品靶基因上可能发生碱基突变,还需进一步进行测序分析。