论文部分内容阅读
目前,抗生素的耐药性日益严重。抗生素耐药作为一种不可避免的自然现象而存在,社会因素和人为因素加速了耐药菌的发展与传播。全球各国耐抗生素感染发病率的上升使一度可以治疗的疾病难以治愈。细菌耐药性主要由细菌自身因素和外界环境两方面引起,包括抗生素的滥用、活化酶的产生、抗生素的泵出、药物作用靶位的改变、耐药菌的传播和变迁等。幽门螺杆菌(H.pylori)是慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病因,并与胃癌、胃黏膜相关淋巴样组织淋巴瘤的发生密切相关。WHO已将幽门螺杆菌列为第一类致癌因子,我国人口感染率约为50-70 %。因此,抗幽门螺杆菌感染的控制和治疗是我们面临的重要医疗和社会问题。随着抗生素的广泛应用,H.pylori对这些抗生素的耐药率亦呈逐年上升的趋势。对于耐药基因的鉴定,长期以来多以药靶基因和药物代谢相关基因的分析为主,如:H.pylori已确定耐甲硝唑的主要原因是rdxA或frxA基因的突变;克拉霉素的耐药与23S rRNA基因点突变有关。但是,耐药相关基因远不止这些,并且存在其它的耐药机制。因此,需要寻找新的耐药性分析的方法。信号标签突变技术(STM)是一种已经成熟应用于病原微生物的功能基因筛选技术,它是通过用病原体全基因组随机插入的突变体在动物体内进行高通量筛选。其基本原理是用带有不同标签的载体分别构建突变株文库,取不同文库中的突变株,混合感染动物、细胞等模型,一定时间后,由于失去耐受环境能力或致病能力的突变株死亡,从而在回收样本中将不能发现其所携带的标签,即取感染灶中的细菌DNA,与该标签探针杂交将呈阴性反应,从而说明该突变株中被突变的基因是致病或特定功能相关基因。高通量筛选方法是筛选鉴定致病相关基因、耐药相关基因以及特定功能相关基因的有效方法。在本实验中,我们用4种平末端限制性内切酶酶切H.pylori基因组DNA,获得300～500 bp的随机片段,克隆入带有不同标签的自杀质粒,经电转化E.coli DH5?,以抗生素筛选获得约1200个重组质粒。该方法中插入片段覆盖了基因组大量的随机序列,为进一步大规模构建H.pylori突变体文库和鉴定其耐药相关基因奠定了基础。结核分枝杆菌感染引起的结核病,是威胁人类健康的重要传染性疾病之一。全世界有近1/3的人感染MTB,近年来结核病的发病率和耐药率明显升高,成为21世纪严重危害人类健康的公共卫生问题和社会问题。因此,临床分子流行病学的研究分析中,对MTB进行DNA指纹图谱分析,使我们对MTB基因水平的遗传多样性有了更深的了解,对传染病学机理和耐药性分析及传播很有价值。通过检测耐药频发基因型菌株的出现和传播,可早期识别并控制耐药株在人群中的传播。DNA指纹分析技术自1983年发现以来,在医学、法律学等领域应用广泛,目前已应用于临床分子流行病学的研究分析中。IS6110-RFLP分型技术是MTB基因分型的金标准,主要是通过检测插入片段IS6110产生的变异对菌株进行分型。rep-PCR的原理是扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列,通过电泳条带比较分析,揭示基因组间的差异。本研究通过对85株结核临床耐药分离株的基因组DNA提取,进行rep-PCR扩增,用Agilent 2100生物分析仪分离DNA片段,最后使用DiversiLab软件分析数据,以相似性cutoff值为70 %将其分为4个基因型。结果显示不同耐药菌株基因组间存在遗传差异,揭示MTB基因型与耐药间无明显相关性,提示结核分枝杆菌的耐药性产生基础广泛,各种基因型菌株均普遍容易产生耐药性。同时I型和II型结核分枝杆菌是主要的流行菌株。这一结论为耐药结核分枝杆菌的全面控制措施的建立提供了新的依据。