肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)约占原发性肝癌的85～90%,是非常常见的癌症之一,发病率在世界恶性肿瘤排名第五位,缺乏有效的早期诊断及预防方法,并且具有极高的复发率和转移率,导致患者的整体预后很差,已成为全世界肿瘤死亡的第三大原因。在我国,肝癌的发病率和病死率居高不下,病死率在肿瘤死因中排名第二,每年约有383000人死于肝癌,占据了全世界因肝癌死亡的51%。肿瘤是一个多步骤、多基因参与的过程,肿瘤研究的先驱Robert A.Weinberg总结了肿瘤发生发展过程中的十大生物学特征,而异常的代谢模式成为肿瘤组织区别于正常组织的重大特征。随着不断深入研究,其在肿瘤发生发展过程中的作用日益被重视。异常的肿瘤代谢不仅为肿瘤细胞的增殖供给能量、合成原料及大量的还原性物质等,同时还影响了肿瘤信号通路传导和基因的表达,进而参与调控肿瘤细胞的快速增殖、凋亡抵抗及迁移侵袭。近年来,肿瘤细胞内葡萄糖的异常代谢是研究最为深入的代谢改变。葡萄糖首先在细胞质代谢转变为丙酮酸,氧气充足时,丙酮酸进入线粒体参与羧酸循环氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP),为细胞的生命活动供给能量,1摩尔葡萄糖通过线粒体氧化磷酸化途径产生36摩尔ATP;缺氧条件下,葡萄糖生成的丙酮酸在细胞质经乳酸脱氢酶转化为乳酸排至胞外,这一代谢过程为糖酵解,1摩尔葡萄糖通过糖酵解可产生2摩尔ATP。德国生化学家Otto Warburg早在1924年发现:即使在氧气充足的情况下,肿瘤细胞优先将糖酵解作为供能方式,将葡萄糖转化而来的丙酮酸大部分通过乳酸脱氢酶还原为乳酸排至胞外,只有少部分丙酮酸进入线粒体参与氧化磷酸化,此种代谢模式的转变即为有氧糖酵解,也称为Warburg效应。随着研究的深入,有氧糖酵解在肿瘤发生发展和迁移侵袭中发挥了重要的调控作用已成为共识。近年来,多项研究显示通过增强氧化磷酸化抑制糖酵解达到了抑制肿瘤的目的,研究者将目光逐渐从有氧糖酵解转向调控氧化磷酸化改变肿瘤细胞赖以生存的代谢模式,从而抑制肿瘤生长。丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex,PDHc)存在于线粒体中,催化丙酮酸转化为乙酰辅酶A进入三羧酸循环参加氧化磷酸化,是决定细胞参加有氧氧化还是糖酵解的中央调控位点。多项研究表明PDHc在肿瘤细胞快速生长、凋亡抵抗、迁移侵袭等过程中发挥重要的作用。丙酮酸脱氢酶复合体 E1α 亚单位(pyruvate dehydrogenase E1α subunit,PDHA1)是 PDHc 活性的主要调节位点,通过磷酸化和去磷酸化调控PDHc的失活或者激活,进而影响线粒体内三羧酸循环和糖酵解的代谢流量。相关研究表明PDHA1在多种肿瘤组织中表达异常,通过影响PDHc活性改变肿瘤细胞葡萄糖的代谢,与肿瘤生长、对放化疗的敏感性、耐药性、预后等密切相关。在前列腺癌、卵巢癌细胞中敲除PDHA1可引起氧化磷酸化受抑,糖酵解增强,ROS水平降低,进而引起肿瘤细胞快速增殖。反之,如果我们通过上调PDHA1基因表达是否会影响肿瘤细胞的代谢与生长,目前尚未见此类报导。鉴于此,本实验以PDHA1为切入点,旨在从糖代谢的角度探讨PDHA1对肿瘤细胞生长的影响及分子机制,进而了解能量代谢的改变与肿瘤增殖、凋亡调控之间的关系。第一部分PDHA1在肝癌组织的表达与生存预后的分析目的:检测PDHA1在肝癌及配对癌旁组织的表达水平,分析PDHA1的表达水平和肝癌临床病理特征之间的关系。方法:1.应用免疫印迹(Western blot)和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测PDHA1在15例肝癌及配对癌旁组织中的表达水平。2.应用免疫组织化学方法检测组织芯片中75例肝癌和配对癌旁组织中PDHA1的蛋白表达,并分析其表达水平与肝癌临床病理特征及预后的关系。结果:1.15例肝癌患者癌组织内PDHA1的mRNA和蛋白的表达水平明显低于癌旁组织。2.75例肝癌和配对癌旁组织中,52例肝癌组织内PDHA1蛋白表达水平比癌旁组织低。PDHA1的表达水平与肝癌体积呈负相关,与病理学分级、TNM分期也有显著相关性。PDHA1蛋白表达越低,患者预后越差。第二部分过表达PDHA1对肝癌细胞葡萄糖代谢的影响目的:1.构建PDHA1过表达慢病毒载体,建立稳定PDHA1过表达的肝癌细胞株。2.研究过表达PDHA1基因对肝癌细胞株SMMC-7721与HepG2细胞内葡萄糖代谢的影响。方法:1.Western blot检测PDHA1在多株肝癌细胞内的蛋白表达水平。2.构建靶向PDHA1基因的过表达慢病毒载体,包装病毒后感染肝癌细胞,嘌呤霉素筛选建立稳定上调PDHA1细胞株,应用Western blot和qRT-PCR方法验证过表达效果后进入后续实验。3.通过检测细胞PDH酶活性、柠檬酸合酶活性、葡萄糖消耗、ATP产量和乳酸产量分析PDHA1过表达对肝癌细胞糖代谢的影响。结果:1.PDHA1 在肝癌细胞株 SMMC-7721、MHCC97-H、BEL-7402、HepG2、QGY-7703和QGY-7701中均有表达,根据表达情况,我们选取基础表达水平较低的HepG2和SMMC-7721细胞作为PDHA1过表达的对象。转染过表达PDHA1慢病毒载体,嘌呤霉素筛选一周后建立稳定细胞株,Western blot和qRT-PCR验证PDHA1过表达有效。2.SMMC-7721和HepG2细胞上调PDHA1表达后,细胞内PDH酶活性升高,柠檬酸合酶活性增强、ATP产量增加,表明上调PDHA1表达可增强线粒体氧化磷酸化;葡萄糖消耗下降,乳酸形成减少,表明上调PDHA1表达可抑制糖酵解代谢。第三部分过表达PDHA1通过ROS/PI3K/Akt诱导肝癌细胞周期阻滞和凋亡目的:1.研究过表达PDHA1对肝癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。2.探索过表达PDHA1通过ROS/PI3K/Akt信号通路诱导细胞周期阻滞和凋亡的分子机制。方法:1.通过CCK8、克隆形成实验了解PDHA1上调对肝癌细胞增殖的影响。2.Edu法检测PDHA1基因过表达对细胞DNA合成能力的影响。3.光学显微镜了解PDHA1表达上调后肝癌细胞形态学改变。4.Hochest 33342及流式细胞术检测过表达PDHA1对肝癌细胞凋亡的影响,Western blot检测凋亡相关蛋白的改变。5.流式细胞术检测过表达PDHA1对细胞周期分布的影响,Westemblot检测细胞周期相关蛋白的改变。6.荧光显微镜和荧光酶标仪检测过表达PDHA1对细胞内ROS水平的影响。7.Western blot检测不同ROS水平对PI3K/Akt通路的影响。8.Western blot检测PDHA1过表达组细胞应用Akt激动剂SC79后PI3K/Akt通路的改变。9.流式细胞术检测肝癌细胞PDHA1过表达组应用Akt激动剂SC79后细胞凋亡的改变,Western blot检测凋亡相关蛋白的变化。10.流式细胞术检测肝癌细胞PDHA1过表达组应用Akt激动剂SC79后细胞周期的变化,Western blot检测细胞周期相关蛋白的改变。结果:1.通过CCK8、Edu及克隆形成实验,发现过表达PDHA1可降低肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2合成DNA的能力,抑制其增殖。2.流式细胞术结果显示过表达PDHA1可诱导细胞周期阻滞于G0/G1期,凋亡增加。3.过表达PDHA1增加肝癌细胞内ROS水平,PI3K/Akt通路受抑制;应用N-乙酰半胱氨酸降低细胞内ROS水平,PI3K/Akt抑制程度减轻,证实过表达PDHA1通过升高ROS抑制PI3K/Akt通路活化。4.应用Akt激动剂SC79处理PDHA1过表达组细胞,凋亡减少,周期阻滞减轻,表明PI3K/Akt信号通路在过表达PDHA1诱导细胞周期阻滞和凋亡的过程中发挥了重要的调控作用。第四部分体内验证PDHA1对肝癌细胞成瘤能力的影响目的:通过裸鼠成瘤实验观察过表达PDHA1对肝癌细胞株活体成瘤能力、糖代谢及凋亡的影响。方法:1.建立裸鼠移植瘤模型,观察过表达PDHA1对肝癌细胞体内成瘤的影响。2.免疫组织化方法检测裸鼠肿瘤组织三羧酸循环限速酶柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶的表达水平。3.Tunel法检测裸鼠肿瘤组织的凋亡情况。结果:1.裸鼠成瘤实验提示过表达PDHA1可抑制SMMC-7721细胞体内成瘤能力。2.免疫组化染色分析显示过表达PDHA1组移植瘤内柠檬酸合酶与异柠檬酸脱氢酶染色增强,表明TCA循环代谢增强。3.Tunel结果显示过表达PDHA1组裸鼠肿瘤组织凋亡增加。全文结论1.PDHA1在肝癌组织中低表达,表达水平与肿瘤大小、病理学分级、TNM分期和预后相关,表达水平越低,预后越差。2.肝癌细胞过表达PDHA1增强PDH酶活性,增加线粒体氧化磷酸化速率,抑制糖酵解。3.体外实验证实,肝癌细胞过表达PDHA1通过ROS/PI3K/Akt通路诱导细胞周期阻滞和凋亡。4.体内裸鼠成瘤实验证实过表达PDHA1可抑制肝癌细胞的成瘤能力,增强三羧酸循环代谢,促进细胞凋亡。