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背景:心肌缺血/再灌注损伤(Myocardial ischemia/reperfusion injury,I/R)普遍存在于心血管病的临床治疗中,如冠心病冠状动脉支架植入术后、心脏体外循环手术后。心肌缺血/再灌注损伤后会导致心肌梗死面积扩大,心肌纤维化加重,心功能下降,最终导致心力衰竭,引起患者死亡。因此,如何减轻再灌注损伤,一直是心血管临床普遍关注的焦点。柠檬酸盐是一种重要的代谢产物,它既促进线粒体能量代谢,又可作为细胞质合成脂肪酸和胆固醇的碳源,而脂肪酸对于形成膜生物体至关重要。在常氧条件下,柠檬酸是由葡萄糖形成的乙酰辅酶A和由谷氨酰胺形成的草酰乙酸合成的,但是在低氧条件下,通过线粒体中的谷氨酰胺代谢通路合成柠檬酸盐。有报道指出,柠檬酸盐预处理可以改善心肌功能,减轻心肌细胞凋亡,降低心肌中caspase-3蛋白表达,但柠檬酸盐预处理能否减轻心肌缺血/再灌注损伤,改善心肌功能,目前尚无研究报道。miRNA是一类具有内源基因编码水平为17-25个核苷酸的非编码单链RNA分子,可通过碱基互补配对与靶标mRNA3’非编码区结合,并通过转录后序列来调节基因表达靶mRNA的水平。最近的研究表明,miRNA与心肌梗塞、心力衰竭、冠心病和其他心血管疾病的发生和发展密切相关,为心血管疾病的研究提供了新的切入点。因此,本研究主要探讨柠檬酸盐预处理对小鼠心肌缺血再灌注后心功能保护及心室重构的影响,阐明柠檬酸盐的具体作用机制,明确柠檬酸盐是否通过miRNA发挥心肌保护作用,为改善患者心肌缺血/再灌注后的临床预后,减轻再灌注损伤提供新的治疗策略。第一部分柠檬酸盐预处理对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响目的:探讨柠檬酸盐预处理减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用,并初步探讨其作用机制。方法:(1)选用1-3日龄的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠,分成三组:SHAM组(不做任何干预),H/R组(缺氧培养3h,复氧3h),H/R+柠檬酸盐预处理组(缺氧3h,复氧3h+柠檬酸盐预处理组)。(2)原代SD大鼠乳鼠心肌细胞行缺氧3h,再复氧3h,构建心肌细胞缺氧/复氧损伤模型。复氧后检测肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)水平、CCK8检测细胞活力、TUNEL原位标记法及DAPI双重染色法检测细胞凋亡、蛋白印迹及RT-PCR实验检测心肌细胞LC3B及microRNA-142表达水平。结果:(1)与SHAM组相比,模型组心肌细胞上清液CK-MB及LDH水平均增高,差异有统计学意义(p<0.05)。与模型组相比,柠檬酸盐预处理组上清液中CK-MB及LDH水平均降低,差异有统计学意义(p<0.05)。(2)CCK8检测结果显示,与SHAM组相比,模型组细胞活力下降,心肌细胞凋亡指数显著增高,差异有统计学意义(p<0.05)。与模型组相比,柠檬酸盐预处理明显减轻心肌细胞凋亡,增加心肌细胞活力,差异均有统计学意义(p<0.05)。(3)TUNEL原位标记法及DAPI双重染色法检测结果进一步提示,与模型组相比,柠檬酸盐预处理能降低心肌细胞凋亡指数,差异有统计学意义(p<0.05)。(4)与模型组相比,柠檬酸盐预处理可显著促进心肌细胞中microRNA-142表达,抑制Rac1表达(p<0.05),抑制心肌细胞中LC3B表达,差异有统计学意义(p<0.05)。小结:柠檬酸盐预处理能减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤,减少心肌细胞凋亡,增加细胞活力,保护心肌细胞免受心肌细胞缺氧/复氧损伤。其作用机制可能与调控microRNA-142/Rac1信号通路及自噬有关。第二部分柠檬酸盐预处理对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用机制研究目的:探讨柠檬酸盐预处理减轻大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用机制,探讨microRNA-142/Rac1信号通路在柠檬酸盐心肌保护中发挥的作用。方法:(1)选用1-3日龄的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠,分成四组:H/R组(缺氧培养3h,复氧3h),H/R+microRNA-142抑制组(缺氧培养3h,复氧3h+microRNA-142沉默),H/R+柠檬酸预处理组(缺氧3h,复氧3h+柠檬酸盐预处理组)及H/R+柠檬酸预处理+microRNA-142抑制组(缺氧3h,复氧3h+柠檬酸盐预处理组+microRNA-142沉默)。(2)原代SD大鼠乳鼠心肌细胞行缺氧3h,再复氧3h,构建心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,模型构建方法如同实验一。复氧后检测肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)及心肌细胞自噬水平、CCK8法检测细胞活力、TUNEL原位标记法及DAPI双重染色法检测细胞凋亡、蛋白印迹及RT-PCR实验检测心肌细胞LC3B、microRNA-142及Rac1表达水平、蛋白印迹实验检测Bax及cleaved caspase-3蛋白表达。结果:(1)与H/R组相比,柠檬酸盐预处理组细胞上清中CK-MB及LDH明显降低,差异有统计学意义(p<0.05)。与柠檬酸盐预处理组相比,柠檬酸盐预处理+microRNA-142抑制组CK-MB及LDH显著升高(p<0.05),说明柠檬酸盐预处理对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤导致的心肌酶学指标的保护作用可被microRNA-142沉默抑制。(2)CCK8法检测结果提示,与H/R组相比,柠檬酸盐预处理可增加心肌细胞活力,差异有统计学意义(p<0.05)。与柠檬酸盐预处理组相比,柠檬酸盐预处理+microRNA-142抑制组细胞活力显著下降(p<0.05),表明抑制microRNA-142表达可降低柠檬酸盐预处理对心肌细胞的保护作用。(3)TUNEL原位标记法及DAPI双重染色法检测结果显示,与H/R组相比,柠檬酸盐预处理组心肌细胞凋亡指数显著减少(p<0.05)。与柠檬酸盐预处理组相比,柠檬酸盐预处理+microRNA-142抑制组心肌细胞凋亡指数增高(p<0.05),表明抑制microRNA-142表达可阻断柠檬酸盐预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤导致凋亡的保护作用。(4)心肌细胞自噬结果表明,与H/R组相比,柠檬酸盐预处理能抑制心肌细胞自噬(p<0.05),进而改善发挥心肌细胞保护作用。与柠檬酸盐预处理组相比,柠檬酸盐预处理+microRNA-142抑制组心肌细胞自噬水平明显增高,表明柠檬酸盐预处理抑制大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤导致的自噬可被阻断。(5)蛋白印迹及RT-PCR实验结果说明,与H/R组相比,柠檬酸盐预处理能显著抑制自噬蛋白LC3B的表达(p<0.05),促进microRNA-142表达,进而抑制Rac1表达(p<0.05),与柠檬酸盐预处理组相比,柠檬酸盐预处理+microRNA-142抑制组心肌细胞自噬水平表达量增高(p<0.05),microRNA-142及Rac1表达降低(p<0.05)。表明柠檬酸盐上调microRNA-142及抑制Rac1表达,进而抑制心肌细胞自噬,发挥心肌细胞的保护作用可被microRNA-142沉默阻断。(6)与H/R组相比,柠檬酸盐预处理可抑制心肌细胞中Bax及cleaved caspase-3的表达,差异均有统计学意义(p<0.05)。与柠檬酸盐预处理组相比,柠檬酸盐预处理+microRNA-142抑制组Bax及cleaved caspase-3的表达均增加(p<0.05)。说明microRNA-142被沉默后,柠檬酸盐抗心肌细胞凋亡的保护作用被阻断。小结:柠檬酸盐预处理可通过microRNA-142/Rac1信号通路,抑制心肌细胞自噬水平,进而下调Bax及cleaved caspase-3的蛋白表达,发挥抗心肌细胞凋亡,减轻心肌细胞缺氧/复氧导致损伤的作用。第三部分柠檬酸盐预处理对小鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响目的:观察柠檬酸盐预处理对小鼠心肌缺血/再灌注损伤的影响,并在体内进一步印证其具体作用机制。方法:(1)选用6-8周雄性C57/B6小鼠,随机分四组:非手术组:假手术组(只开胸不行小鼠左冠状动脉前降支结扎,SHAM组),单纯柠檬酸盐预处理组(只开胸不行小鼠左冠状动脉前降支结扎+柠檬酸预处理,Citrate组);模型组:心肌缺血/再灌注模型组(行小鼠左冠状动脉前降支结扎,I/R组)以及心肌缺血/再灌注+柠檬酸盐预处理组(小鼠左冠状动脉前降支结扎+柠檬酸盐预处理,I/R+Citrate组)。(2)结扎小鼠左冠状动脉前降支使其缺血45min,再灌注24h,构建小鼠心肌缺血再灌注模型。再灌注24h后检测小鼠左心室射血分数(Left Ventricular Ejection Fraction,LVEF)、左室缩短分数(Left Ventricular Fractional Shortening,LVFS)及心率(Heart Rate,HR)、TTC(Triphenyl Tetrazolium Chloride)染色法检测心肌梗死面积、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)水平、蛋白印迹实验检测Bax及cleaved caspase-3蛋白表达,蛋白印迹及RT-PCR实验检测心肌细胞自噬(LC3B)、microRNA-142及Rac1水平。结果:(1)与SHAM组相比,单纯行柠檬酸盐预处理组血清中的CK-MB及LDH均无明显变化,差异无统计学意义(p>0.05),模型组血清中的CK-MB及LDH均有显著的升高,差异有统计学意义(p<0.05)。与模型组相比,柠檬酸盐预处理组中的CK-MB及LDH均降低,差异有统计学意义(p<0.05)。(2)与SHAM组相比,柠檬酸盐预处理组心肌梗死面积无明显变化,差异无统计学意义(p>0.05),模型组心肌梗死面积增加,差异有统计学意义(p<0.05)。与模型组相比,注射用柠檬酸盐预处理后,小鼠心肌梗死面积减小,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)超声心动图检测了HR、LVEF、LVFS及Cardiac Output(CO)。各组之间HR差异不大,无统计学意义(p>0.05)。与SHAM组相比,模型组的小鼠心肌功能损害严重,表现为LVEF(p<0.05)及LVFS(p<0.05)明显降低。应用柠檬酸盐预处理治疗能改善小鼠的心肌功能,表现为LVEF(p<0.05)及LVFS(p<0.05)升高。(4)蛋白及RT-PCR实验检测了自噬蛋白LC3B,发现与SHAM组相比,柠檬酸预处理组表达无明显变化,而模型组LC3B表达量明显上调。与模型组相比,注射用柠檬酸盐预处理后,小鼠心肌内的LC3B表达量明显下降。(5)蛋白印迹实验结果显示,与SHAM组相比,模型组的Bax及cleaved caspase-3的表达增加,差异均有统计学意义(p<0.05)。与模型组相比,柠檬酸盐预处理显著降低了Bax和Cleaved caspase-3的表达(p<0.05)。(6)与SHAM组相比,模型组的microRNA-142的蛋白及基因水平均下调,而Rac1蛋白及基因水平却上调,差异有统计学意义(p<0.05)。与模型组相比,柠檬酸盐预处理显著上调了小鼠microRNA-142的表达,抑制了Rac1的表达,差异有统计学意义(p<0.05),说明柠檬酸盐可通过microRNA-142/Rac1信号通路发挥作用。小结:(1)柠檬酸盐预处理能改善小鼠的心肌缺血再灌注损伤,表现为显著改善左心室射血分数、缩短分数及心排出量,降低心肌梗死面积、CK-MB及LDH水平。(2)柠檬酸盐预处理可能通过调控microRNA-142/Rac1信号通路,抑制心肌自噬,下调Cleaved caspase-3和Bax的蛋白表达,进而发挥抗细胞凋亡,减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤的作用。