由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)感染引起的病毒性肝炎呈全球分布,世界人口的3%即大约1.7亿人为HCV慢性携带者,发展中国家高于发达国家。2006-全国病毒性肝炎血清流行病学调查显示,我国人群丙肝感染率为0.6%。HCV感染自然转阴率低,极易慢性化,治疗效果差,且与肝硬化肝癌的发生及发展密切相关。对于丙肝感染的预防,目前仍无有效的疫苗,主要通过增加检测试剂的敏感性和特异性,减少经血造成的丙肝传播。对丙肝病毒抗体的检测是判断是否感染的第一步,包括用于筛检的EIA和用于确证的RIBA,其中RIBA因高昂的费用和缺少已建立的试验标准,已较少用于临床的诊疗。EIA因具有方便稳定、便于自动化和价格低廉等优点,目前广泛用于血液筛查和临床检测。虽然EIA已经发展到第三代,但仍采用间接法进行检测,由于间接法检测存在假阳性率高的问题,尤其是在丙肝低流行人群中,假阳性率达到30%(95%CI：15%-60%),给个人和社会造成了不必要的疾病负担。建立一种在不降低检测敏感性同时增加特异性的方法就显得尤为必要。HIV和梅毒的抗体检测,均已采用特异性更好的双抗原夹心法代替原来的间接法检测。而建立抗-HCV抗体双抗原夹心检测的主要难点在于抗原的标记。因HCV主要的B细胞表位之一核心蛋白CORE富含碱性氨酸,若直接对抗原进行标记,会造成这些位点被封闭,降低了检测的敏感性甚至造成漏检。为此,我们在传统的双抗原夹心法的基础上建立一种新型的桥式双抗原夹心法。将桥蛋白TRX与丙肝抗原蛋白融合表达作为夹心抗原,通过酶标记的抗-TRX mAb与TRX特异性结合使丙肝抗原蛋白间接酶标记,与包被抗原一起对样品中的HCV抗体进行检测。在本实验室已构建好的含有HCV河北株(NCBI Accession NO. L02836) NS3(1201、1465位氨基酸)、CORE(1、34位氨基酸)和NS4(1929-1935位氨基酸)编码序列的质粒pETHd-C44P的基础上,采用PCR扩增NS3-CORE-NS4编码序列,克隆入表达质粒pET43.1a-TRX(由本室改造),构建重组质粒pET43.1a-TRX-C44P.分别将pETHd-C44P和pET43.1a-TRX-C44P转化BL21(DE3)E.coli感受态细胞,IPTG诱导表达后,Western blotting鉴定表明C44P和TRX-C44P的抗原性良好。采用硫酸沉淀富集粗提取、离子交换色谱初步纯化和凝胶过滤层析精致提纯后,包被抗原C44P可达95%的纯度；采用硫酸沉淀富集粗提取、离子交换色谱两个步骤对夹心抗原TRX-C44P纯化后,可达到90%以上的纯度。通过优化包被抗原和酶标二抗的工作浓度、包被液和样品稀释液的成分以及孵育条件,确定了间接法检测丙肝病毒抗体的具体条件。通过优化包被和抗原夹心抗原以及酶标记抗-TRX mAb的工作浓度、检测样品用量、孵育条件和不同检测模式(两步法/三步法),确定了双抗原夹心法对丙肝病毒抗体的检测的具体条件。采用建立的间接法和夹心法以及两种商品化丙肝抗体检测试剂盒(万泰和英科新创,均为间接法)对156份献血员筛查不合格血清和600份遂宁市病毒性肝炎流调血清中的抗-HCV抗体进行平行检测,对检测结果不一致的样品进行双孔复测。以两种商品化试剂的检测结果来判定检测样品的抗-HCV状态,若两者检测结果一致,则认为是相应的阴阳性结果。对两者的检测结果有差异的样品采用Real-time PCR进行确证。结果显示：有733份样品四种检测的结果一致,包括52份阳性,681份阴性；22份样品两种商品化试剂、夹心法检测一致均为阴性,但建立的间接法为阳性的,这些样品按照本试验规定的结果判定标准为阴性,建立的间接法的测定结果为假阳性；有3份样品为一种商品化试剂检测为弱阳性,夹心法检测为阴性,建立的间接法检测结果可阴可阳,这些样品的HCV RNA检测均为阴性,不能确定其HCV感染状态,不计入统计处理；1例样品两种商品化试剂均为阴性,但间接法和夹心法均为阳性,这例样品的HCV RNA检测为阴性,可能为所选择的抗原位点有误检导致的假阳性结果。对于全部的756份样品,总体anti-HCV阳性率6.88%,本实验建立的夹心法敏感性为100%,特异性为99.86%,一致率为99.87%；阳性预测值为98.1%,阴性预测值为100%。建立的间接法敏感性为100%,特异性为96.59%,一致率为96.83%；阳性预测值为68.4%,阴性预测值为100%。综上所述,建立的夹心法敏感性、特异性不低于商品化丙肝抗体检测试剂。从方法学上,夹心法的敏感性不低于间接法,但特异性优于间接法。