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脂肪酶（lipase,EC3.1.1.3）属于羧基酯水解酶类,用于催化水解三酰甘油,广泛存在于自然界中,其中微生物是脂肪酶的重要来源。目前对酵母、曲霉、假单胞菌、青霉、根霉等产脂肪酶的微生物研究较多。本课题主要研究的对象是米曲霉来源的脂肪酶,我们从NCBI数据库（Genbank）中选择了8种米曲霉脂肪酶基因,进行目标基因的人工合成并在大肠杆菌中实现异源表达。论文对脂肪酶酶活最高的脂肪酶基因进行分子改造,进一步提升其酶活性,并对获得的脂肪酶突变体的酶学性质进行了研究,研究结果如下:1、首先成功在大肠杆菌中表达了8种米曲霉脂肪酶基因,并对其基本酶学性质进行了研究。对根据大肠杆菌密码子偏好性优化的8种米曲霉脂肪酶基因进行人工合成,连接在质粒pET-28a（+）中,并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中实现表达,成功构建8株重组脂肪酶工程菌。将这8株工程菌进行摇瓶发酵,离心获得菌体,经超声破碎后得到8种重组脂肪酶的粗酶液,并测定其水解活性,发现经过实验室前期挖掘和研究的AOL-3的酶活力最高,为521.12 U/g。实验对8种脂肪酶的最适温度、pH以及底物特异性进行了初步研究,发现米曲霉脂肪酶的反应最适温度在30℃-40℃之间,最适pH在6.5-7.5之间,且每一种脂肪酶都有不同的催化底物偏好性。2、实验对米曲霉脂肪酶AOL-3进行分子改造。利用易错PCR技术,结合定点饱和突变,用以三丁酸甘油酯为底物的平板来进行高效快速的筛选。第一轮随机突变后,筛到一株编号为AOL-3（38/93）的突变菌株,是AOL-3第38位的苯丙氨酸（F）突变为天冬酰胺（N）,其脂肪酶突变体命名为AOL-3F38N。脂肪酶突变体AOL-3F38N酶液的比酶活为1770.9 U/g,原始酶AOL-3酶液酶活521.12 U/g的3.6倍。在第一轮突变筛到的突变子基础上进行了第二轮随机突变,筛选到一株突变株编号为AOL-3（38/93-230/6）,是脂肪酶AOL-3F38N第230位的缬氨酸（V）突变为精氨酸（R）,其脂肪酶突变体命名为AOL-3F38N/V230R,酶液的比酶活为2094.48 U/g,是原始酶AOL-3的4.0倍。3、对脂肪酶突变体AOL-3F38N/V230R和原始AOL-3酶进行了纯化,并对AOL-3F38N/V230R的酶学性质进行了研究。AOL-3F38N/V230R和原始酶AOL-3经镍离子亲和层析后的比酶活是分别是186.81 U/mg和46.64 U/mg。脂肪酶突变体AOL-3F38N/V230R最适温度和pH分别为40℃和7.5,与原始酶AOL-3相同。在35℃-65℃的温度范围都有较好的温度稳定性,当pH大于8.0时,AOL-3F38N/V230R的酶活较低,且稳定性较差。AOL-3F38N/V230R对不同碳链长度乙酯的水解特异性发生了变化,优先水解的碳链长度从C4变为C6-C10,对中长链乙酯的水解活性有所提高,底物特异性范围变宽。在低浓度（1 mM）的金属离子环境下,实验组的金属离子对脂肪酶突变体AOL-3F38N/V230R都没有明显的抑制作用,其中Mn2+等有激活作用。在较高浓度（5 mM）的金属离子条件下,金属离子对AOL-3F38N/V230的活性具有较大的影响,Zn2+、Fe3+、Ni+完全抑制AOL-3F38N/V230的活性,Mg2+、Mn2+金属离子则有较明显的激活作用。原始酶AOL-3的Km为2.40 mM和Vmax为7.89 mM/min,脂肪酶突变体AOL-3F38N/V230R的Km为1.92 mM和Vmax为12.22mM/min。