【摘 要】
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本研究以溶血性曼氏杆菌基因组为模板,PCR扩增PlpE基因,构建重组质粒pET-32a-PlpE,进行原核表达、SDS-PAGE检测、Western-Blot检测、抗PlpE蛋白多克隆抗体的制备,并应用表达蛋白建立间接ELISA方法。结果表明,本研究成功克隆并表达了PlpE基因,对纯化后蛋白进行SDS-PAGE检测,结果显示本研究获得纯度较高目的蛋白;Western-Blot试验表明,PlpE蛋白
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本研究以溶血性曼氏杆菌基因组为模板,PCR扩增PlpE基因,构建重组质粒pET-32a-PlpE,进行原核表达、SDS-PAGE检测、Western-Blot检测、抗PlpE蛋白多克隆抗体的制备,并应用表达蛋白建立间接ELISA方法。结果表明,本研究成功克隆并表达了PlpE基因,对纯化后蛋白进行SDS-PAGE检测,结果显示本研究获得纯度较高目的蛋白;Western-Blot试验表明,PlpE蛋白能够和溶血性曼氏杆菌牛阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性;以PlpE蛋白作为抗原,成功制备抗PlpE蛋白多克隆抗体,其抗体效价高达1:512 000。以PlpE蛋白作为包被抗原,建立了检测PlpE抗体的间接ELISA方法并优化了各项试验条件。最终确定建立的间接ELISA方法各条件为:抗原最佳包被量2μg/m L,血清最佳稀释度为1:300;最佳封闭液为1%鸡卵清白蛋白;最佳二抗稀释度为1:80 000;最佳封闭时间2 h;样品最佳反应时间30 min;酶标二抗最佳反应时间45 min;最佳显色时间为15 min。通过对临床40份牛血清的检测,根据统计学原理计算得出临界值为0.69。当样品在OD450≥0.69时,判定为阳性,≤0.56时则判定为阴性;处于0.56～0.69范围内属于可疑,应对样品进行复检。该方法成功表达PlpE蛋白,并建立检测PlpE抗体间接ELISA方法。
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