【摘 要】
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目的 通过RT-PCR克隆人pot1(protection oftelomeres 1)基因cDNA,研究其过表达以及RNAi对HeLa细胞的影响,并初步探讨其作用机制;同时,建立检测pot1基因表达的凝胶迁移滞后试
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目的 通过RT-PCR克隆人pot1(protection oftelomeres 1)基因cDNA,研究其过表达以及RNAi对HeLa细胞的影响,并初步探讨其作用机制;同时,建立检测pot1基因表达的凝胶迁移滞后试验(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)方法.方法 从HeLa细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出人pot1基因编码区全长cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3质粒中,筛选阳性克隆并进行DNA全序列分析,阳性重组载体经脂质体转染HeLa细胞,转染48h后提取细胞总RNA和蛋白质分别进行RT-PCR和EMSA电泳分析检测外源基因的表达;合成3组编码短发夹RNA序列的寡核苷酸DNA单链,退火,克隆到真核表达载体pmU6质粒中,重组的siRNA表达载体经脂质体转染HeLa细胞48h后提取细胞总RNA和蛋白质分别进行RT-PCR和EMSA电泳分析检测基因的表达抑制效率;阳性重组载体和siRNA表达载体经脂质体瞬时转染HeLa细胞后,通过Hoechst33342染色检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞周期,DAPI染色检测染色体的形态变化.结论 成功构建了pcDNA3-hpot1真核表达载体和3种siRNA表达载体;pcDNA3-hpot1转染Hela细胞后均能有效过表达,siRNA表达载体转染Hela细胞后均能有效地干扰pot1基因表达;确立了有效的hPOT1蛋白的检测方法-EMSA;pcDNA3-hpot1真核表达载体和3种siRNA表达载体瞬时转染后对细胞凋亡无明显影响;人pot1基因过表达后细胞被阻滞于细胞周期的S期;4种表达载体转染细胞后染色体出现不同程度的端端融合现象.该文为进一步探讨hpot1基因的生物学作用及其机理提供了新的实验依据.
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