棉花是世界上最重要的天然纤维作物，我国是重要的产棉大国和纺织品出口国，棉花在我国国民经济中占有十分重要的地位。棉花纤维是棉花生产的主产品，提高棉花纤维的产量和品质一直是棉花育种的主要目标。传统育种方法曾经为棉花产量和品质的提高做出了巨大贡献，但利用传统育种方法难以打破纤维产量和品质的负相关，难以达到产量和品质的同步提高。利用基因工程方法可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移，且后代易于稳定，育种周期短。为进一步改良棉花纤维产量和品质提供了一条有效途径。利用基因工程改良棉花纤维的产量和品质必须具备两个条件：①清楚棉花纤维产量和品质形成的分子机理，②克隆与纤维产量和品质发育直接相关的目标基因和调控序列。因此，分离与棉花纤维产量和品质发育相关基因及其特异启动子，分析基因功能和解析纤维发育的分子机制对改良棉花纤维产量和品质具有重要的理论意义和实践价值。植物激素调控植物生长发育的各个方面，因此棉花纤维的生长发育也离不开植物激素的调控。油菜素类固醇物质(BRs)是一类新型的植物激素，外源施用结果表明BRs能提高棉花的产量和品质。然而外源施用植物激素不仅耗工费时、增加生产成本，而且效果也不稳定。利用基因工程调控棉花胚珠和纤维中内源BRs的水平，不仅可以阐明BRs在棉花纤维发育中的作用，还可以改良棉花纤维的产量和品质。细胞骨架在棉花纤维的生长发育中也具有重要作用，纤维细胞的伸长和次生壁的合成与周质微管的排列模式具有密切关系。细胞伸长时，周质微管横向排列；细胞次生壁合成时，周质微管纵向排列，且周质微管的排列方向与新形成的纤维素微纤丝的排列方向高度一致。微管排列方向的变化与调控微管聚合和解聚的因子有直接关系，调控微管的排向可以影响纤维的伸长和次生壁合成，改变纤维的品质。为了调控棉花内源BRs的含量和微管骨架的排列模式，我们克隆了BRs生物合成的限速酶基因——类同醇5α-还原酶基因和调控微管运动的重要基因——微管切割蛋白基因。并对其进行了表达分析和酶活性鉴定，然后利用烟草和棉花的遗传转化分析了棉花类固醇5α-还原酶基因(GhDET2)和棉花微管切割蛋白基因(GhKTN1)的功能。主要结果如下：一、棉花类固醇5α-还原酶基因(GhDET2)的功能1、棉花类固醇5α-还原酶基因的克隆和表达分析通过对棉花纤维发育EST序列的筛选和整合，利用3’-RACE，克隆了GhDET2基因。该基因氨基酸序列与拟南芥、矮牵牛和大豆等物种的类固醇5α-还原酶有较高的同源性，并具有同类蛋白应有的保守结构域和发挥正常生物功能所必需的保守氨基酸残基。说明GhDET2基因是类固醇5α-还原酶的同源基因。该基因在棉花基因组中以单拷贝存在，且编码区段没有内含子。5’-上游序列比较表明GhDET2基因可能来源于D亚基因组。Northern和RT-PCR结果表明：GhDET2基因在棉花纤维细胞快速伸长期(5～10DPA)的表达水平最高，同时该基因在徐州142无绒无絮突变体0DPA胚珠中的表达水平仅为同期野生型胚珠的1／5。这些结果显示GhDET2基因在棉花纤维的起始和快速伸长过程中具有重要作用。2、GhDET2的生物化学功能鉴定为了验证GhDET2的生物化学功能，将GhDET2基因导入中国仓鼠卵母细胞(CHO)中表达。体外还原系统检测结果表明，GhDET2能够将类同醇5α-还原酶的典型底物——黄体酮还原成为二氢黄体酮，说明GhDET2具有类同醇5α-还原酶的活性。并且GhDET2的活性能够被类固醇5α-还原酶的特异抑制剂——Finasteride抑制，进一步说明克隆的GhDET2基因就是棉花类固醇5α-还原酶基因。3、通过转基因烟草分析了GhDET2基因的功能为了分析GhDET2基因在植物生长中的功能，将GhDET2基因导入烟草。GhDET2基因的超量表达可以增加转基因烟草的生物生长量，促进营养生长和生殖生长。转基因种子的千粒重增加53.1％。下胚轴长度增加80％。根的长度增加190％。并且能够促进侧根、不定根以及根毛的发生和生长，以及增强根尖对重力的反应。这些表型变异与外源施用BL有相似之处。同时利用类固醇5α-还原酶的特异抑制剂Finasteride则可以抑制野生型烟草根和下胚轴的生长，减弱转基因烟草根和下胚轴的生长。这些结果说明超量表达GhDET2基因增加了内源BRs的含量。并以此分析了BRs与其它植物激素的相互关系：IAA与BRs在对下胚轴生长上是相互独立的，对根生长上是相互拮抗的；与此相反，IBA与BRs在对下胚轴生长上是相互拮抗的，对根生长上是相互独立的。BRs与细胞分裂素对根的生长具有独立作用，而对下胚轴的生长具有相互拮抗关系。BRs与赤霉素在根生长方面存在协同作用关系，而在对下胚轴生长两者具有一定的拮抗作用。BRs与脱落酸在种子萌发和根生长方面具有拮抗作用，但对下胚轴的生长具有相对独立性。4、超量表达和反义抑制GhDET2对棉花生长和纤维细胞发育的影响为了研究GhDET2基因在棉花生长发育、特别是纤维生长发育中的功能，获得了超量表达和反义抑制GhDET2的转基因棉花，分析了转基因棉花的表型变化。超量表达GhDET2基因导致棉花植株矮化、侧枝变短增多、顶端优势减弱；花粉育性下降、棉桃在开花后3～5天脱落、不能得到成熟的种子和纤维。反义抑制GhDET2基因导致棉花植株严重矮化、侧枝变短、叶小色深；顶端优势和花粉育性丧失、棉桃在开花后3～5天脱落、不能得到成熟的种子和纤维。扫描电镜观察发现反义抑制GhDET2的转基因胚珠表面突起的纤维细胞明显减少，而且伸长受到抑制。进一步采用胚珠离体观察纤维细胞的发育：反义抑制GhDET2和类固醇50α-还原酶抑制剂处理均导致纤维的伸长生长受到严重抑制，而添加油菜素内酯则可部分恢复纤维细胞的伸长。表明GhDET2对纤维细胞的起始与伸长均有重要影响。5、种皮特异启动子控制senseGhDET2提高了棉纤维细胞数量和长度组成型超量表达正向与反义GhDET2基因导致植株生长不正常，为了排除植株生长不正常对纤维细胞发育的影响，利用种皮特异性启动子PFBP7构建了PFBP7：：senseGhDET2和PFBP7：：antisenseGhDET2植物表达载体并进行了棉花遗传转化。表达分析显示GhDET2基因的表达水平在部分PFBP7：：senseGhDET2转基因胚珠和纤维中有所提高，相反，在PFBP7：：antisenseGhDET2转基因胚珠和纤维中有一定程度的降低。在GhDET2基因表达明显提高的植株中纤维细胞的起始数量增加了22.6％，成熟纤维的长度增加了10.75％，种子变大，短绒增加，但纤维的强度和细度没有明显变化。相反，在PFBP7：：antisenseGhDET2转基因植株中，伴随GhDET2基因表达水平的降低，纤维细胞的起始数量减少了21.4％，成熟纤维的长度降低了6.38％，这些结果在植株水平上说明GhDET2基因对棉纤维细胞的起始和伸长具有重要作用，可作为基因工程改良棉纤维产量和品质的重要基因。二、棉花微管切割蛋白基因(GhKTN1)的功能1、棉花微管切割蛋白基因的克隆和表达分析通过对棉花纤维发育EST序列的筛选和整合，克隆了棉花微管切割蛋白基因(GhKTN1)的部分cDNA序列。经过基因组步行，获得GhKTN1基因的完整ORF框序列，全长1563bp，编码520个氨基酸。该氨基酸序列与拟南芥和水稻微管切割蛋白的同源性较高，且具有微管切割蛋白保守的AAATPase结构域，推导的三维结构与拟南芥微管切割蛋白的三维结构基本一致。说明GhKTN1基因是微管切割蛋白的同源基因。GhKTN1在16DPA和20DPA纤维中的表达水平明显跃升。说明该基因在纤维次生壁合成起始和次生壁合成过程中具有重要作用。2、GhKTN1能够调控纤维细胞次生壁合成起始和促进次生壁合成Paredez等人(2006)的研究表明，微管的运动与纤维素的合成密切相关。本研究中超量表达和反义抑制GhKTN1基因都使微管的排列方式发生明显改变；微管切割蛋白基因表达水平的增加，可以促进微管的运动，进而促进纤维素的合成。本研究对弄清微管运动与纤维细胞发育的机理有重要的理论意义。提高GhKTN1基因的表达水平导致纤维长度缩短，纤维次生壁厚度增加，纤维强度增加；反之，降低GhKTN1基因的表达水平导致纤维次生壁厚度减少、纤维强度降低。GhKTN1基因的表达水平的提高使纤维细胞次生壁增厚时间提前。因此，控制该基因表达的水平与时间有可能改进棉花纤维的强度与长度。本研究为棉花纤维品质的改良提供了新的策略。