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肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的原发性肝癌，其全球发病率和死亡率在癌症中分别排名第六位和第四位。越来越多的临床和流行病学研究表明，代谢相关脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)是HCC的独立危险因素，由于其快速增长的发病率，MAFLD正成为HCC的主要致病因素之一。相关研究发现，肝脏脂质从头合成(de novo lipogenesis，DNL)异常升高不仅参与MAFLD进展，而且是HCC等多种肿瘤发展的关键因素。然而，其分子机制尚未完全阐明。
负责DNL的关键酶，例如脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FASN)、乙酰辅酶A羧化酶1(Acetyl-CoA carboxylase 1，ACC1)、ATP柠檬酸裂合酶(ATP citrate lyase，ACL)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-Coenzyme A desaturase 1，SCD1)均在HCC中高表达。固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs)是脂质从头合成的主要调控因子，调节多种DNL关键酶。其中，SREBP1c主要在肝脏表达并调节肝脏脂质代谢。最近研究发现，SREBP1c高表达可以促进HCC的发展。因此，解析SREBP1c的调节机制，发现调控SREBP1c的关键调控因子将为HCC治疗提供重要的潜在靶标。
ZHX2(Zinc fingers and homobox2)是2003年鉴定的转录因子，属于ZHX家族。我们前期实验发现，ZHX2通过转录抑制细胞周期基因、多药耐药基因和HBx等多种机制在HCC中发挥抑癌作用。家族性高脂血症的遗传分析表明Zhx2基因是高脂血症易感基因，且ZHX2降低小鼠肝脏脂质水平，保护小鼠免受高脂饮食诱导的肝损伤，强烈提示ZHX2参与脂质代谢调控。我们最近研究发现ZHX2抑制肝细胞中脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)介导的外源脂质摄取，从而抑制MAFLD及其相关HCC进展。然而，ZHX2是否参与脂质从头合成尚不清楚。
本论文旨在探究ZHX2对脂质从头合成的调控作用及分子机制，以期揭示HCC发生发展新通路，为HCC治疗提供新策略。
一、ZHX2抑制肝癌细胞的脂质从头合成过程
为了明确ZHX2在HCC细胞脂质从头合成中的作用，利用转染技术在肝癌细胞系HepG2和Huh7细胞中过表达或干扰ZHX2，并以含碳吸附胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的培养液培养。BODIPY染色结果显示ZHX2过表达显著降低HCC细胞中性脂质染色强度，敲降ZHX2则增加细胞内脂质水平。与此相对应，ZHX2明显抑制HepG2和Huh7细胞中的游离脂肪酸(free fatty acids，FFAs)及甘油三酯(triglyceride，TG)水平。
D-Glucose-13C6示踪技术是研究脂质从头合成的最直接手段。为进一步确定ZHX2在脂质从头合成过程中的作用，利用含D-Glucose-13C6培养液培养Dox诱导过表达ZHX2的HepG2细胞，UHPLC-QTOF-MS分析13C标记的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸(此两类脂肪酸主要衍生自脂质的从头合成)。结果显示，与对照组相比，ZHX2过表达的HepG2细胞中13C标记的新合成脂肪酸明显减少。RT-qPCR证明ZHX2抑制HepG2和Huh7细胞中脂肪生成关键酶基因ACL、ACC1、FASN和SCD1的表达。综上所述，ZHX2显著抑制HCC细胞的脂质从头合成过程。
二、ZHX2通过抑制脂质从头合成进而抑制肝癌细胞增殖
脂质从头合成不仅是多种肿瘤的重要特性，而且对细胞增殖至关重要。本实验室前期研究证明ZHX2是一种新型HCC抑制因子，对HCC细胞的增殖具有显著抑制作用。为了研究ZHX2是否通过调节脂质从头合成发挥其肿瘤抑制功能，同上在HepG2和Huh7细胞中进行ZHX2过表达或干扰后，在碳吸附FBS条件下培养，并进行集落形成和细胞增殖测定。结果显示ZHX2过表达显著抑制HCC细胞的增殖，表现为集落形成能力降低和生长速率下降。更重要的是，用单不饱和脂肪酸-油酸(oleieacid，OA，脂质从头合成的主要产物之一)处理后，这种抑制作用几乎完全消除。相反，干扰ZHX2表达明显促进了HCC细胞的增殖和集落的形成，并且这种促进作用被ACL(BMS-303141)和SCD1(A939572)抑制剂消除。以上结果表明，ZHX2通过抑制脂质从头合成来降低HCC细胞的增殖。
三、ZHX2通过抑制SREBP1c表达负调控肝癌细胞的脂质从头合成
SREBP1是脂质从头合成的关键调控因子，转录调控DNL多种关键酶表达。为了验证ZHX2是否调节SREBP1，我们在肝癌细胞中过表达或敲降ZHX2，RT-qPCR和westernblot(WB)检测肝脏中特异性表达的SREBP1c亚型。结果显示，ZHX2过表达显著抑制HepG2和Huh7细胞中SREBP1c的mRNA和蛋白表达，而ZHX2的沉默则明显增加了SREBP1c的表达。RT-qPCR检测显示，在HCC患者临床标本中ZHX2mRNA水平与SREBP1cmRNA水平显著负相关，进一步提示ZHX2抑制SREBP1c表达。
为了评估SREBP1c在ZHX2抑制脂质从头合成过程中的作用，进一步在HepG2和Huh7细胞中过表达/干扰ZHX2后进行SREBP1c拯救实验，同上检测中性脂质、游离脂肪酸和甘油三酯的含量。与预期相一致，ZHX2的过表达降低肝癌细胞中的中性脂质以及游离脂肪酸和甘油三酯的水平，而SREBP1c的过表达则明显消除了ZHX2对肝癌细胞脂质合成的阻遏作用。相反，SREBP1c抑制剂Fatostatin或者SREBP1c-siRNA明显逆转敲降ZHX2导致的中性脂质、FFA及TG升高。综上所述，ZHX2通过抑制SREBP1c表达负调控脂质生成。
四、ZHX2通过下调SREBP1c抑制肝癌细胞增殖和肿瘤形成
为验证ZHX2是否通过抑制SREBP1c来实现对肝癌细胞的抑制作用，同上在肝癌细胞系中进行ZHX2干预及SREBP1c拯救，并检测细胞体外生长变化。结果显示，SREBP1c过表达不仅促进HCC细胞的集落形成和增殖能力，而且几乎完全挽救了ZHX2过表达对HCC细胞生长的抑制作用。相反，Fatostatin或siSREBP1c抑制HCC细胞生长，并消除了干扰ZHX2对HepG2和Huh7细胞集落形成和细胞增殖的增强作用。
为了进一步验证ZHX2-SREBPc轴体内抑制肝癌的作用，选择6-8周龄雄性Zhx2肝细胞特异敲除鼠(AlbCre+;Zhx2fl/fl，Zhx2-KOhep)和同窝对照鼠(Alb Cre-;Zhx2fl/fl，WT)，尾静脉高压注射SB(Sleeping Beauty)转座子系统和AKT/Myc质粒，诱导肝癌;同时腹腔注射SREBP1抑制剂Fatostatin。8周后处死小鼠。观察发现，Zhx2-KOhep小鼠肝脏中肿瘤(＞1毫米)数量明显多于WT小鼠，且肝重、肝体重比、肝匀浆中游离脂肪酸和甘油三酯含量显著增加。更重要的是，Fatostatin处理后显著减少了Zhx2-KOhep和WT小鼠的肝肿瘤结节数量、肝匀浆中游离脂肪酸和甘油三酯含量，并消除了Zhx2-KOhep和WT组之间的差异。
上述结果表明，ZHX2通过下调SREBP1c，进而抑制肝癌细胞体内外增殖。
五、ZHX2通过miR-24-3p抑制SREBP1c表达
作为转录因子，ZHX2可能在转录水平抑制SREBP1c。我们首先克隆SREBP1c启动子区域，进行双萤光素酶测定实验。结果表明，ZHX2对SREBP1c的启动子活性没有影响。此外，ChIP以及公开的ChIP-seq数据显示，ZHX2并不能和SREBP1c启动子结合。
越来越多的数据表明miRNA介导的转录后基因沉默在脂质代谢调控中发挥重要作用。为筛选可能参与ZHX2调控SREBP1c的候选miRNA，对过表达ZHX2的HepG2细胞和对照细胞进行microarray分析。差异miRNA分析结合软件预测(www.mircode.org和www.targetscan.org)，显示ZHX2过表达后61个显著上调的miRNA(＞4倍)中有六个可能靶向SREBP1c，随后用ZHX2过表达的HepG2和Huh7细胞验证上述miRNA的表达。RT-qPCR结果表明，ZHX2显著上调了miR-24-3p，但不影响其他miRNA表达。进一步的过表达和干扰实验证实，ZHX2过表达显著增加肝癌细胞miR-24-3p水平，而敲降ZHX2则明显降低miR-24-3p。同样，双荧光素酶报告实验表明，ZHX2明显增强了miR-24-3p启动子的活性，提示ZHX2通过增强miR-24-3p的启动子活性来促进其表达。
为了确认SREBP1c是否受miR-24-3p调控，分别将miR-24-3p抑制剂、类似物、过表达质粒转染到HepG2细胞中，RT-qPCR及WB检测SREBP1c表达。结果显示，miR-24-3p抑制剂明显增强SREBP1c的表达，而miR-24-3p类似物及过表达质粒抑制SREBP1c的表达。进一步构建含有miR-24-3结合位点的SREBP1c报告质粒，共转染及双荧光素酶报告基因实验结果显示，抑制miR-24-3p明显增加荧光素酶水平，过表达miR-24-3p降低了荧光素酶水平，表明miR-24-3p可调控SREBP1表达。
为确定miR-24-3p在ZHX2抑制SREBP1c中的作用，在HepG2细胞中过表达或干扰ZHX2的同时进行miR-24-3p拯救实验。结果显示，miR-24-3p抑制剂显著逆转了ZHX2过表达对SREBP1c的抑制作用。相反，miR-24-3p类似物及过表达质粒转染后明显消除了ZHX2siRNA导致的SREBP1c增加，提示ZHX2通过上调miR-24-3p抑制SREBP1c表达。
上述结果表明，ZHX2通过促进miR-24-3p启动子活性，增强miR-24-3p表达，从而进一步抑制SREBP1c的表达。
六、ZHX2通过miR-24-3p抑制肝癌细胞脂质从头合成和细胞增殖
为明确miR-24-3p在ZHX2抑制肝癌细胞脂质从头合成和细胞增殖中的作用，同上在HepG2细胞中进行拯救实验，并检测游离脂肪酸水平，集落形成和细胞增殖能力。结果显示，miR-24-3p抑制剂转染显著逆转了ZHX2过表达介导的FFA水平降低、细胞生长和集落形成抑制，而miR-24-3p类似物及过表达质粒转染消除了ZHX2干扰引起的FFA水平升高、细胞生长和集落形成促进。因此，ZHX2在转录水平上促进miR-24-3p的表达，从而抑制脂质合成及肝癌细胞增殖。
结论与研究意义:综上所述，我们的研究首次证实肝癌抑制因子ZHX2是脂质从头合成的重要抑制因子，ZHX2显著抑制脂质从头合成关键调节因子SREBP1c并抑制肝癌细胞脂质从头合成，进而发挥抑癌基因作用减缓HCC进展。机制研究发现，ZHX2在转录水平促进miR-24-3p表达，进而靶向SREBP1c并抑制其表达。我们的结果揭示了肝癌脂代谢重编程的新机制，发现了肝癌抑制基因ZHX2的新靶点和新通路，为肝癌的治疗提供新的策略。
负责DNL的关键酶，例如脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FASN)、乙酰辅酶A羧化酶1(Acetyl-CoA carboxylase 1，ACC1)、ATP柠檬酸裂合酶(ATP citrate lyase，ACL)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-Coenzyme A desaturase 1，SCD1)均在HCC中高表达。固醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs)是脂质从头合成的主要调控因子，调节多种DNL关键酶。其中，SREBP1c主要在肝脏表达并调节肝脏脂质代谢。最近研究发现，SREBP1c高表达可以促进HCC的发展。因此，解析SREBP1c的调节机制，发现调控SREBP1c的关键调控因子将为HCC治疗提供重要的潜在靶标。
ZHX2(Zinc fingers and homobox2)是2003年鉴定的转录因子，属于ZHX家族。我们前期实验发现，ZHX2通过转录抑制细胞周期基因、多药耐药基因和HBx等多种机制在HCC中发挥抑癌作用。家族性高脂血症的遗传分析表明Zhx2基因是高脂血症易感基因，且ZHX2降低小鼠肝脏脂质水平，保护小鼠免受高脂饮食诱导的肝损伤，强烈提示ZHX2参与脂质代谢调控。我们最近研究发现ZHX2抑制肝细胞中脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase，LPL)介导的外源脂质摄取，从而抑制MAFLD及其相关HCC进展。然而，ZHX2是否参与脂质从头合成尚不清楚。
本论文旨在探究ZHX2对脂质从头合成的调控作用及分子机制，以期揭示HCC发生发展新通路，为HCC治疗提供新策略。
一、ZHX2抑制肝癌细胞的脂质从头合成过程
为了明确ZHX2在HCC细胞脂质从头合成中的作用，利用转染技术在肝癌细胞系HepG2和Huh7细胞中过表达或干扰ZHX2，并以含碳吸附胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的培养液培养。BODIPY染色结果显示ZHX2过表达显著降低HCC细胞中性脂质染色强度，敲降ZHX2则增加细胞内脂质水平。与此相对应，ZHX2明显抑制HepG2和Huh7细胞中的游离脂肪酸(free fatty acids，FFAs)及甘油三酯(triglyceride，TG)水平。
D-Glucose-13C6示踪技术是研究脂质从头合成的最直接手段。为进一步确定ZHX2在脂质从头合成过程中的作用，利用含D-Glucose-13C6培养液培养Dox诱导过表达ZHX2的HepG2细胞，UHPLC-QTOF-MS分析13C标记的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸(此两类脂肪酸主要衍生自脂质的从头合成)。结果显示，与对照组相比，ZHX2过表达的HepG2细胞中13C标记的新合成脂肪酸明显减少。RT-qPCR证明ZHX2抑制HepG2和Huh7细胞中脂肪生成关键酶基因ACL、ACC1、FASN和SCD1的表达。综上所述，ZHX2显著抑制HCC细胞的脂质从头合成过程。
二、ZHX2通过抑制脂质从头合成进而抑制肝癌细胞增殖
脂质从头合成不仅是多种肿瘤的重要特性，而且对细胞增殖至关重要。本实验室前期研究证明ZHX2是一种新型HCC抑制因子，对HCC细胞的增殖具有显著抑制作用。为了研究ZHX2是否通过调节脂质从头合成发挥其肿瘤抑制功能，同上在HepG2和Huh7细胞中进行ZHX2过表达或干扰后，在碳吸附FBS条件下培养，并进行集落形成和细胞增殖测定。结果显示ZHX2过表达显著抑制HCC细胞的增殖，表现为集落形成能力降低和生长速率下降。更重要的是，用单不饱和脂肪酸-油酸(oleieacid，OA，脂质从头合成的主要产物之一)处理后，这种抑制作用几乎完全消除。相反，干扰ZHX2表达明显促进了HCC细胞的增殖和集落的形成，并且这种促进作用被ACL(BMS-303141)和SCD1(A939572)抑制剂消除。以上结果表明，ZHX2通过抑制脂质从头合成来降低HCC细胞的增殖。
三、ZHX2通过抑制SREBP1c表达负调控肝癌细胞的脂质从头合成
SREBP1是脂质从头合成的关键调控因子，转录调控DNL多种关键酶表达。为了验证ZHX2是否调节SREBP1，我们在肝癌细胞中过表达或敲降ZHX2，RT-qPCR和westernblot(WB)检测肝脏中特异性表达的SREBP1c亚型。结果显示，ZHX2过表达显著抑制HepG2和Huh7细胞中SREBP1c的mRNA和蛋白表达，而ZHX2的沉默则明显增加了SREBP1c的表达。RT-qPCR检测显示，在HCC患者临床标本中ZHX2mRNA水平与SREBP1cmRNA水平显著负相关，进一步提示ZHX2抑制SREBP1c表达。
为了评估SREBP1c在ZHX2抑制脂质从头合成过程中的作用，进一步在HepG2和Huh7细胞中过表达/干扰ZHX2后进行SREBP1c拯救实验，同上检测中性脂质、游离脂肪酸和甘油三酯的含量。与预期相一致，ZHX2的过表达降低肝癌细胞中的中性脂质以及游离脂肪酸和甘油三酯的水平，而SREBP1c的过表达则明显消除了ZHX2对肝癌细胞脂质合成的阻遏作用。相反，SREBP1c抑制剂Fatostatin或者SREBP1c-siRNA明显逆转敲降ZHX2导致的中性脂质、FFA及TG升高。综上所述，ZHX2通过抑制SREBP1c表达负调控脂质生成。
四、ZHX2通过下调SREBP1c抑制肝癌细胞增殖和肿瘤形成
为验证ZHX2是否通过抑制SREBP1c来实现对肝癌细胞的抑制作用，同上在肝癌细胞系中进行ZHX2干预及SREBP1c拯救，并检测细胞体外生长变化。结果显示，SREBP1c过表达不仅促进HCC细胞的集落形成和增殖能力，而且几乎完全挽救了ZHX2过表达对HCC细胞生长的抑制作用。相反，Fatostatin或siSREBP1c抑制HCC细胞生长，并消除了干扰ZHX2对HepG2和Huh7细胞集落形成和细胞增殖的增强作用。
为了进一步验证ZHX2-SREBPc轴体内抑制肝癌的作用，选择6-8周龄雄性Zhx2肝细胞特异敲除鼠(AlbCre+;Zhx2fl/fl，Zhx2-KOhep)和同窝对照鼠(Alb Cre-;Zhx2fl/fl，WT)，尾静脉高压注射SB(Sleeping Beauty)转座子系统和AKT/Myc质粒，诱导肝癌;同时腹腔注射SREBP1抑制剂Fatostatin。8周后处死小鼠。观察发现，Zhx2-KOhep小鼠肝脏中肿瘤(＞1毫米)数量明显多于WT小鼠，且肝重、肝体重比、肝匀浆中游离脂肪酸和甘油三酯含量显著增加。更重要的是，Fatostatin处理后显著减少了Zhx2-KOhep和WT小鼠的肝肿瘤结节数量、肝匀浆中游离脂肪酸和甘油三酯含量，并消除了Zhx2-KOhep和WT组之间的差异。
上述结果表明，ZHX2通过下调SREBP1c，进而抑制肝癌细胞体内外增殖。
五、ZHX2通过miR-24-3p抑制SREBP1c表达
作为转录因子，ZHX2可能在转录水平抑制SREBP1c。我们首先克隆SREBP1c启动子区域，进行双萤光素酶测定实验。结果表明，ZHX2对SREBP1c的启动子活性没有影响。此外，ChIP以及公开的ChIP-seq数据显示，ZHX2并不能和SREBP1c启动子结合。
越来越多的数据表明miRNA介导的转录后基因沉默在脂质代谢调控中发挥重要作用。为筛选可能参与ZHX2调控SREBP1c的候选miRNA，对过表达ZHX2的HepG2细胞和对照细胞进行microarray分析。差异miRNA分析结合软件预测(www.mircode.org和www.targetscan.org)，显示ZHX2过表达后61个显著上调的miRNA(＞4倍)中有六个可能靶向SREBP1c，随后用ZHX2过表达的HepG2和Huh7细胞验证上述miRNA的表达。RT-qPCR结果表明，ZHX2显著上调了miR-24-3p，但不影响其他miRNA表达。进一步的过表达和干扰实验证实，ZHX2过表达显著增加肝癌细胞miR-24-3p水平，而敲降ZHX2则明显降低miR-24-3p。同样，双荧光素酶报告实验表明，ZHX2明显增强了miR-24-3p启动子的活性，提示ZHX2通过增强miR-24-3p的启动子活性来促进其表达。
为了确认SREBP1c是否受miR-24-3p调控，分别将miR-24-3p抑制剂、类似物、过表达质粒转染到HepG2细胞中，RT-qPCR及WB检测SREBP1c表达。结果显示，miR-24-3p抑制剂明显增强SREBP1c的表达，而miR-24-3p类似物及过表达质粒抑制SREBP1c的表达。进一步构建含有miR-24-3结合位点的SREBP1c报告质粒，共转染及双荧光素酶报告基因实验结果显示，抑制miR-24-3p明显增加荧光素酶水平，过表达miR-24-3p降低了荧光素酶水平，表明miR-24-3p可调控SREBP1表达。
为确定miR-24-3p在ZHX2抑制SREBP1c中的作用，在HepG2细胞中过表达或干扰ZHX2的同时进行miR-24-3p拯救实验。结果显示，miR-24-3p抑制剂显著逆转了ZHX2过表达对SREBP1c的抑制作用。相反，miR-24-3p类似物及过表达质粒转染后明显消除了ZHX2siRNA导致的SREBP1c增加，提示ZHX2通过上调miR-24-3p抑制SREBP1c表达。
上述结果表明，ZHX2通过促进miR-24-3p启动子活性，增强miR-24-3p表达，从而进一步抑制SREBP1c的表达。
六、ZHX2通过miR-24-3p抑制肝癌细胞脂质从头合成和细胞增殖
为明确miR-24-3p在ZHX2抑制肝癌细胞脂质从头合成和细胞增殖中的作用，同上在HepG2细胞中进行拯救实验，并检测游离脂肪酸水平，集落形成和细胞增殖能力。结果显示，miR-24-3p抑制剂转染显著逆转了ZHX2过表达介导的FFA水平降低、细胞生长和集落形成抑制，而miR-24-3p类似物及过表达质粒转染消除了ZHX2干扰引起的FFA水平升高、细胞生长和集落形成促进。因此，ZHX2在转录水平上促进miR-24-3p的表达，从而抑制脂质合成及肝癌细胞增殖。
结论与研究意义:综上所述，我们的研究首次证实肝癌抑制因子ZHX2是脂质从头合成的重要抑制因子，ZHX2显著抑制脂质从头合成关键调节因子SREBP1c并抑制肝癌细胞脂质从头合成，进而发挥抑癌基因作用减缓HCC进展。机制研究发现，ZHX2在转录水平促进miR-24-3p表达，进而靶向SREBP1c并抑制其表达。我们的结果揭示了肝癌脂代谢重编程的新机制，发现了肝癌抑制基因ZHX2的新靶点和新通路，为肝癌的治疗提供新的策略。