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研究背景 在我国,原发性肝癌的死亡率占恶性肿瘤疾病第二位,严重威胁了人民的生命健康。虽然各种治疗方法层出不穷,但肝癌的死亡率和复发转移率仍居高不下。肝癌的发生是一个复杂的过程,涉及多种信号通路的激活。中医药根据整体原则进行辨证论治,综合考虑全身状态,被认为是我国肿瘤防治的一大特色。解毒方是我科在长期实践中创制的中药复方,在治疗原发性肝癌中取得较好的临床疗效,但作用机制尚未完全明确。前期研究已经证实解毒方可以有效干预TGF-β诱导的肝癌细胞增殖、侵袭迁移以及上皮间质转化。有研究显示,TGF-β作为肝癌中广泛调控因子,可以调控巨噬细胞M2型极化,那么对于有效降低巨噬细胞M2型极化这一抗肝癌环节,解毒方是否不仅仅作用于TGF-β本身,也对TGF-β的相关通路具有调节作用,从而实现多靶点的抗肝癌作用呢?本课题在前期大鼠肝癌模型确认解毒方的抗肝癌作用与抑制巨噬细胞M2型极化有关的基础上,基于m RNA芯片通路分析,结合文献报道,对解毒方调控巨噬细胞M2型极化的作用机制进行了初步的探究。研究目的 1.观察TGF-β和AGE信号对肿瘤相关巨噬细胞氧化应激水平和M2型极化调控机制。2.明确解毒方能否通过调控TGF-β和AGE-RAGE信号通路,进而调控巨噬细胞氧化应激水平,抑制巨噬细胞M2型极化并进一步抑制肝癌迁移。研究方法 1.通过对前期解毒方干预后肝癌动物模型中肝癌组织炎性相关差异基因进行生物信息学分析,筛选解毒方作用于肝癌炎性微环境的可能靶点。2.猫人参、石见穿、山慈菇、鸡内金四味中药的比例分别按1:1:0.4:0.4比例进行准备,委托上海融禾医药科技发展有限公司进行深加工。将浸膏粉磨细,进行过滤。称取1g已过滤细粉,加入1m L DMSO溶解后,加入15m L无血清的DMEM培养基进一步溶解,离心后使用DMEM定容至20m L,放入–20℃冰箱储存。3.采用TGF-β、TGF-β+JDF、AGE、TGF-β+AGE、TGF-β+AGE+JDF处理小鼠巨噬细胞RAW264.7,实时荧光定量RT-PCR检测Arg-1、CD163、IL10和CD206m RNA水平。通过荧光显微镜观察巨噬细胞ROS水平。通过Western blotting实验观察RAGE、p47phox、NOX、p-ERK蛋白的表达。4.采用TGF-β、AGE、TGF-β+AGE、TGF-β+AGE+JDF处理小鼠巨噬细胞RAW264.7,获取条件培养基。并进一步采用RAW264.7条件培养基处理Hepa 1-6小鼠肝癌细胞,transwell小室观察肝癌细胞迁移,Western blotting检测肝癌细胞的Ecadherin、N-cadherin、Vimentin和TWIST1蛋白水平。结果 1.对解毒方调控的351条炎症相关差异基因进行IPA分析发现,巨噬细胞中ROS和NO产生相关通路是解毒方作用于肝癌的重要信号通路,进一步的GO和KEGG分析显示,NOX诱导的氧化应激是重要的生物学过程,AGE-RAGE信号通路是重要的信号通路。2.实时荧光定量RT-PCR显示,TGF-β能显著上调提高RAW264.7巨噬细胞的Arg-1、CD163和IL-10 m RNA水平（P＜0.05）,而解毒方组Arg-1、CD163和IL-10m RNA水平较TGF-β组显著降低;AGE+TGF-β组Arg-1、CD163 m RNA水平较TGF-β及AGE单药组显著升高。3.TGF-β和AGE能单独上调巨噬细胞内ROS活性,而TGF-β+AGE较单独使用TGF-β或AGE能显著上调ROS水平。4.与对照组及TGF-β、AGE单药处理组相比,TGF-β+AGE显著促进巨噬细胞p47phox、NOX4和RAGE的表达,上调ERK磷酸化水平（P＜0.001）,解毒方能显著抑制TGF-β和AGE诱导的NOX4、p47phox、RAGE表达和ERK磷酸化（P＜0.001）。当分别阻断TGF-β、RAGE、NOX、ROS信号后,p47phox、NOX4和RAGE的表达均低于TGF-β+AGE联合刺激组。5.与对照组及TGF-β、AGE单药处理组相比,TGF-β+AGE联合处理的RAW264.7细胞条件培养基显著提高Hepa1-6肝癌细胞迁移数目（P＜0.001）,而解毒方可以抑制上述作用。6.TGF-β+AGE处理的RAW264.7细胞条件培养基可以上调肝癌细胞N-cadherin、Vimentin和TWIST1蛋白的表达,下调其E-cadherin蛋白的表达（P＜0.001）,而解毒方可以显著抑制上述效应（P＜0.001）。结论 1.TGF-β与AGE通过p47phox-NOX-ROS通路进行串话,相互增强,促进巨噬细胞M2型极化。2.解毒方通过抑制TGF-β和AGE介导的巨噬细胞氧化应激,抑制巨噬细胞M2极化,进一步抑制M2型巨噬细胞介导的肝癌细胞迁移。