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研究目的:1.建立一种能够在体外快速大量扩增T淋巴细胞的培养方法。2.评估冻存前T细胞状态对复苏后细胞增殖能力、表型和功能的影响。3.建立GPC3特异性T细胞,提高肝细胞癌（HCC）患者肿瘤过继性免疫治疗T细胞的杀瘤能力。研究方法:1.取HCC患者外周血,分离外周血单个核细胞（PBMCs）,设ALyS?培养技术为实验组:应用ALyS505N培养基,添加IL-2诱导;设传统培养方法为对照组:应用1640培养基,添加IFN-γ、IL-2及IL-1α三种细胞因子;观察不同时间点两组细胞形态、数目、细胞表型和杀伤效率。2.分离HCC患者PBMCs,按照培养不同阶段0,4,8,12天冻存细胞,保存2个月后复苏,台盼蓝检测细胞活性,MTS法检测细胞增殖能力,流式检测细胞表型,ELISPOT检测IFN-γ和IL-10的分泌。3.分离脐带血PBMCs,贴壁60-90分钟,取贴壁细胞制备DC,分别使用HepG2冻融抗原及GPC3表位抗原肽负载DC,TNF-α促进DC成熟,第8天收集。光镜观察细胞形态,流式细胞术检测DC表面抗原CD80、CD86、CD83表达。收集同份脐带血悬浮细胞,与第8天诱导成熟的不同组别DC共培养7天,收集细胞,流式细胞术检测T细胞亚群、Th细胞极化及CCR4、CCR5、CCR6、CXCR3和CXCR4趋化因子。研究结果:1.培养第18天后实验组细胞总数显著高于对照组（2-2.8倍）（P<0.05）,两组中活细胞比例均高于95%。两组细胞CD25+比例均至第7天达峰值,且在培养至第7、14天,实验组显著高于对照组（P<0.05）。流式细胞仪检测,两组中CD3+,CD8+,CD3+CD56+细胞比例均随培养时间延长而上升,实验组培养至18天达CD8+细胞比例（58.80±11.26）%,显著高于对照组（40.35±4.98）%,（P<0.05）。实验组诱导T淋巴细胞对肿瘤细胞株SMMC-7721杀伤效率显著高于对照组,是对照组的1.6-2.6倍。2.各组细胞经过2个月冻存后再次复苏均能够保持比较好细胞形态,各组冻存细胞活率均>90%。MTS法对复苏的各组细胞再次培养的增殖能力进行检测,发现4天（F/T）组,8天（F/T）组和12天（F/T）组OD值于复苏后继续培养24小时出现显著增加,而0天（F/T）组OD值复苏后72小时组出现显著增加。各组细胞培养14天成熟后,进行流式细胞仪检测,与新鲜培养成熟的T细胞相比,4天（F/T）组,8天（F/T）组和12天（F/T）组CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞比例无显著变化,而0天（F/T）组CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞比例发生变化,且具有统计学意义;0天（F/T）,4天（F/T）和8天（F/T）组培养成熟后NKT细胞的比例显著下降,而12天（F/T）组无显著变化;0天（F/T）和4天（F/T）组对培养成熟后Treg细胞的比例显著升高,而8天（F/T）和12天（F/T）组无显著变化。ELISPOT结果显示冻存不会影响再次培养成熟的T细胞分泌IFN-γ的能力,而冻存后再次培养细胞中,8天（F/T）和12天（F/T）组T细胞分泌的IL-10显著下降。3.观察到不同致敏方式均能诱导出具有典型形态的DC。流式细胞术检测,培养第7天的各组DC表面抗原CD83、CD80和CD86均有表达,符合分化成熟的DC标志;与未加入DC的T细胞组相比,致敏与未致敏DC均能在体外刺激CD8+T淋巴细胞比例升高,CD4+T淋巴细胞比例降低,但不同的致敏方式间CD8+T、CD4+T淋巴细胞比例无统计学差异;与未加入DC的T细胞组相比,GPC3表位抗原肽致敏DC诱导的T细胞中(DC-GPC3144-152-T组和DC-GPC3298-306-T组),Th1细胞占总CD4+T细胞的比例显著增加,而Th2细胞比例显著减少;与未加入DC的T细胞组相比,致敏与未致敏DC诱导的T细胞(DC-T组、DC-GPC3144-152-T组、DC-GPC3298-306-T组、DC-HepG2-T组)均能够提高CCR6、CXCR3的表达;与未致敏DC诱导的T细胞（DC-T组）相比,不同致敏方式(DC-GPC3144-152-T组、DC-GPC3298-306-T组、DC-HepG2-T组)均能诱导CCR6表达升高,GPC3298-306致敏DC诱导的T细胞(DC-GPC3298-306-T组)CCR5表达升高。研究结论:采用ALyS?培养技术能够有效的扩增HCC患者的T淋巴细胞,增加其中效应T细胞数量。经过8和12天培养的T细胞冻存细胞复苏后再次培养即能恢复到与新鲜培养时的相同状态。GPC3表位抗原肽能够有效的致敏DC;与T细胞共培养时能够诱导培养的T淋巴细胞亚群中的CD8+T细胞比例升高,并能够有效的提高CCR6、CXCR3的表达。