乳腺癌的发病率在所有女性肿瘤中占首位，达22.9%，并且乳腺癌的致死率也在女性癌症中排名第一。近年来乳腺癌在中国妇女中的发病率正悄然上升，在过去的十年间，北京、上海乳腺癌的发病率上升分别超过20%及30%，已接近西方乳腺癌高发国家的水平，因此加强对乳腺癌发生与发展的机制研究已刻不容缓。Hedghog（Hh）/Gli信号通路是一条经典的胚胎发育信号系统，在胚胎发育和胚胎形成后细胞的生长和分化过程中都起着重要作用。转录因子Gli1既是Hh通路下游的效应分子，也是该通路调节的靶蛋白，其表达也是Hh/Gli信号通路激活的标志。尽管已有研究表明，Hh/Gli通路参与了乳腺的正常发育，且与乳腺癌的发生、发展密切相关。例如，Gli1及其他Hh通路成员在乳腺癌组织中常见异常表达；Gli1的高表达可以促进乳腺癌细胞的增殖，并能抑制雌激素受体（estrogenreceptorα，ERα）的表达。但是Gli1对乳腺癌其他生物学行为的影响还不很清楚，对其作用的机制也缺乏深入的研究。加之乳腺癌是一种包含多种类型的不均一性疾病。除了不同的病理类型外，还可根据癌细胞雌激素受体（ER）的表达情况，分为雌激素依赖型（ER阳性）和非依赖型（ER阴性）乳腺癌两大类型。不同类型乳腺癌之间具有明显不同的生物学特性和临床表现。Hedghog（Hh）/Gli信号通路对这两种不同乳腺癌的增殖、分化、迁移等是否有不同的影响也不清楚。MCF-7和T47D细胞是ER阳性的雌激素依赖性细胞系，其分化程度相对比较高，而增殖和侵袭能力都比雌激素非依赖性乳腺癌细胞，如MDA-MB-231和SK-BR-3细胞低。本校病理生理教研室在前期研究中发现Gli1在MCF-7和T47D中的表达明显低于MDA-MB-231和SK-BR-3，并显示Gli1的表达水平与ER的表达呈负相关，与乳腺癌的增殖呈正相关。本课题在前期研究的基础上，拟进一步研究Gli1在乳腺癌增殖、粘附、迁移、抗凋亡等生物学行为中的作用及可能机制。我们首先建立了持续性稳定高表达Gli1的MCF-7、T47D细胞系，观察高表达Gli1对乳腺癌细胞粘附、迁移、抗凋亡等生物学特性的影响，继而通过全基因组寡核苷酸微阵列芯片分析，寻找转染Gli1表达质粒的MCF-7细胞与转染空载质粒的MCF-7细胞之间的差异表达基因，分析受Gli1调控的基因在乳腺癌生物学行为中的作用，并预测乳腺癌细胞中Gli1的靶基因，探讨Gli1影响乳腺癌生物学特性的可能机制，进一步研究Gli1在乳腺癌发生发展中作用，寻找乳腺癌的治疗的可能靶点。为研究Gli1在乳腺癌发生和发展中的作用，全文由以下三个部分组成：第一部分稳转高表达Gli1对乳腺癌细胞增殖、迁移、粘附和凋亡的影响目的：探讨Gli1在乳腺癌细胞增殖、粘附、迁移、凋亡等生物学行为中的作用。方法：采用细胞增殖实验、粘附实验、Transwell迁移实验等，与转染空载质粒的对照细胞相比，观察稳定转染高表达Gli1对乳腺癌MCF-7、T47D细胞株增殖、粘附、迁移的影响。给予紫杉醇(paclitaxel,PTX)100nM处理24小时、48小时，采用CCK-8法检测高表达Gli1对PTX凋亡诱导下细胞存活率的影响。结果：成功建立稳转高表达Gli1的MCF-7、T47D细胞株及稳转空载质粒的对照细胞。稳转高表达Gli1促进乳腺癌细胞增殖，并能明显促进细胞的粘附；其中稳转高表达Gli1的MCF-7、T47D细胞粘附能力分别是对照细胞的1.58、1.41倍（p<0.05）；Transwell小室迁移实验中发现稳转高表达Gli1的MCF-7细胞组迁移的细胞数为对照的31.6%（p<0.05）。紫杉醇处理细胞24h、48h，各个时间点高表达Gli1细胞组细胞的存活率均高于对照组（P<0.05）。结论：高表达Gli1能促进乳腺癌细胞MCF-7、T47D的增殖、粘附，抑制乳腺癌细胞MCF-7的迁移，促进其在凋亡诱导剂PTX作用下的存活。第二部分Gli1调控的靶基因的筛选与鉴定目的：筛选Gli1调控的基因，探讨Gli1对乳腺癌生物学行为影响的可能机制，寻找Gli1的靶基因。方法：采用人全基因组寡核苷酸微阵列芯片技术，筛选稳转高表达Gli1的MCF-7与对照细胞之间的差异表达基因，并用QRT-PCR方法验证。生物信息学分析预测Gli1可能的靶基因，采用QRT-PCR方法检测重组人Hedgehog通路配体SHH-N（recombinanthumanSHHN-turminus，rhSHH-N）处理MCF-7细胞4小时后GLI1、CCL2、BIRC3mRNA的变化，推测其是否为Gli1的直接靶基因。结果：基因芯片共筛选出Gli1-MCF-7与对照细胞差异表达基因338个，其中表达上调的基因有179个，表达下调的基因有159个，随机挑选部分基因，采用QRT-PCR方法验证，其mRNA表达情况与基因芯片结果一致。信号通路分析提示，这些基因编码的蛋白功能涉及细胞增殖、凋亡、粘附、趋化、炎症反应、泛素化、代谢等各方面，其中，BTG1、SESN1、CLDN2、BIRC3、CCL2等改变基因可能是Gli1影响乳腺癌细胞生物学行为的机制之一。经分析，潜在靶基因BIRC3、CCL2基因的启动子区域有Gli1的结合序列。用rhSHH-N蛋白处理MCF-7细胞4小时，观察到BIRC3、CCL2的mRNA表达的增加，推测BIRC3、CCL2可能为GLI1的靶基因。结论：Gli1调控的基因涉及粘附、凋亡、转移、炎症反应等方面，这些被调控的基因参与了Gli1对乳腺癌各种生物学行为的作用。其中BIRC3、CCL2可能为Gli1的直接靶基因。第三部分影响乳腺癌细胞Gli1表达的因素目的：基于雌激素（17β-estradiol,E2）对乳腺癌发生发展的重要作用，观察雌激素、雌激素受体ERα对Gli1表达、转录活性的影响。并观察血清浓度对Gli1表达的影响。方法：乳腺癌MCF-7细胞给予E2处理不同时间，采用QRT-PCR、WesternBlot方法分别检测Gli1的mRNA、蛋白的表达。MCF-7中采用脂质体瞬时转染ERα，荧光素酶报告基因方法检测Gli1转录活性的改变。分别用含10%、5%、2.5%、0.5%的去激素血清培养液培养MCF-7细胞24h，QRT-PCR方法检测Gli1mRNA表达的改变。结果：雌激素E2能时间依赖性地上调乳腺癌MCF-7细胞Gli1的表达，36h时mRNA表达最高，为对照的4.36倍，各时间点Gli1mRNA表达量与对照相比均有统计学差异（p<0.05）；瞬时转染ERα能增加Gli1的转录活性至对照1.97倍（p<0.05）。随着血清浓度的减低，Gli1mRNA的表达逐渐升高。结论：雌激素E2可上调Gli1的表达。瞬时转染高表达ERα能增强Gli1的转录活性。此外，血清浓度的降低可上调Gli1的表达，推测Gli1可能在应激、炎症等不良因素下表达，利于乳腺癌细胞的存活。