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Toll样受体（toll-like receptors, TLRs）是免疫细胞识别病原体分子的一类重要受体，也在心肌细胞、血管内皮细胞、神经元等多种细胞表达，参与细胞应激和炎症反应等生理病理过程。已被克隆的人类TLRs有11种亚型，被报道在鼠类心肌细胞表达的包括TLR2/3/4/5/7/9亚型。HSP60(heat shock protein60)是HSPs家族的成员之一，生理状态下主要位于线粒体内（约70-80%），小部分位于胞浆。文献报道，外源性HSP60（胞外HSP60）能够激活巨噬细胞和成纤维细胞的TLR2和TLR4受体，导致肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素（interleukin，IL）等致炎因子产生，但胞外HSP60是否影响TLR2和TLR4受体表达未见报道。我们前期报道，在心肌缺血大鼠模型，HSP60异常出现在血清中，即出现胞外HSP60（Lin et al,AJP,2007;293: H2238-47）。我们预实验发现，在培养的大鼠H9c2心肌细胞系，外源性HSP60能够上调TLR2和TLR4表达，而缺血心肌TLR2和TLR4表达也上调。因此，我们推测，心肌缺血时，异常出现在血液中的HSP60（胞外HSP60）很可能不仅作为配体激活心肌细胞的TLR2和/或TLR4，而且能够上调心肌表达TLR2和TLR4。为证明这一假设，本课题在正常培养的H9c2心肌细胞，研究了外源性HSP60上调TLR2/4表达的作用及信号机制；并且，在H9c2心肌细胞模拟缺血模型和整体大鼠心肌缺血模型，研究了内源性胞外HSP60上调TLR2/4表达的作用及信号机制。研究方法在大鼠H9c2心肌细胞模型中，给予外源性HSP60或模拟缺血（无血清+低糖+1%低氧），ELISA法检测培液上清HSP60含量检测模拟缺血是否引起HSP60出胞；通过real-time PCR和Western blot法检测TLR2/4表达；通过特异性阻断HSP60信号通路中的主要信号分子“TLR4、MyD88、p38、JNK和NF-κB”，研究HSP60上调TLR2/4表达的信号机制。在整体大鼠心肌缺血模型中，结扎冠状动脉左前降支（LAD）造成心肌缺血以及静脉注射HSP60抗体来中和封闭血浆中的HSP60后，通过real-time PCR和Western blot法检测心肌TLR2/4表达；ELISA法和Western blot法检测血浆HSP60。研究结果1.在培养的大鼠H9c2心肌细胞系，外源性HSP60通过TLR4-MyD88-JNK/NFκB信号通路介导上调TLR2和TLR4表达：外源性HSP601μg/mL使得TLR2和TLR4mRNA水平和蛋白表达量均显著上调；特异性阻断HSP60信号通路中的主要信号分子“TLR4、MyD88、p38、JNK和NF-κB”结果表明，TLR4siRNA、MyD88抑制性多肽（Inhi MyD88）、JNK抑制剂SP600125、NF-κB抑制剂PDTC四种干预能够显著抑制外源性HSP60引起的TLR2和TLR4表达上调，而TLR2siRNA和p38抑制剂SB203580无显著效应，表明HSP60上调TLR2/4表达的效应由TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路所介导。TLR4siRNA不仅抑制TLR4表达，而且显著抑制HSP60引起的TLR2/4上调，TLR2siRNA仅仅抑制TLR2表达，不影响HSP60引起的TLR2/4上调。2.在模拟缺血培养的大鼠H9c2心肌细胞，HSP60出现在胞外，并且经TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路参与介导模拟缺血所致TLR2和TLR4表达上调：在培养的大鼠H9c2心肌细胞，模拟缺血引起培液上清中出现HSP60，即HSP60出现在胞外；同时，模拟缺血引起TLR2/4表达上调，用抗体特异性封闭胞外HSP60或者阻断信号分子TLR4、 MyD88、 JNK和NF-κB能够显著抑制该效应，表明“胞外HSP60-TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路”参与介导模拟缺血所致TLR2/4表达上调。3.在整体大鼠心肌缺血模型，HSP60异常出现在血浆中，并且参与介导缺血所致心肌TLR2和TLR4表达上调：在冠状动脉左前降支（LAD）结扎所致大鼠急性心肌缺血模型，我们用Western blot和ELISA法均检测到LAD结扎4h后血清中出现HSP60，而假手术组（sham）基本检测不到，表明心肌缺血引起HSP60异常出现在胞外； LAD结扎后4h，Western blot法检测到左室前壁、左室后壁、右室以及室间隔中TLR2和TLR4受体表达水平均显著高于假手术组（sham），表明LAD结扎后，全心脏TLR2和TLR4表达上调；用HSP60抗体中和血清中的HSP60，观察到能够显著抑制心肌缺血引起的TLR2和TLR4表达上调，而对照抗体IgG没有抑制效应，表明胞外HSP60参与介导心肌缺血所致TLR2/4表达上调。结论1.在培养的大鼠H9c2心肌细胞系，外源性HSP60上调TLR2和TLR4表达，该效应由TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路所介导。2.在模拟缺血培养的大鼠H9c2心肌细胞， HSP60出现在胞外，并且经TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路参与介导模拟缺血所致TLR2和TLR4表达上调。3.在整体大鼠心肌缺血模型，HSP60异常出现在血浆中，并且参与介导缺血所致心肌TLR2和TLR4表达上调。上述研究表明，心肌缺血时HSP60异常出现在胞外，胞外HSP60通过TLR4-MyD88-JNK/NFκB通路使得心肌细胞TLR2/4表达上调，该作用是缺血心肌TLR2/4表达上调的机制之一。