金钗石斛(Dendrobium nobile)是我国传统名贵中草药,为兰科(orchidaceae)多年生附生性草本植物,富含多糖、生物碱、倍半萜类等多种活性成分,具有抗肿瘤、抗衰老、降血糖等多种疗效,提高金钗石斛的有效成分含量对于改善其药用品质有着重要的医学价值。通过施用JA等诱导物以促进红豆杉等药用植物次生代谢产物积累已经被广泛研究。然而,这些诱导子是否同样具有促进石斛碱等次生代谢物的产生,还未见报道。本研究考察了三种诱导物分子水杨酸(SA),一氧化氮(NO)和茉莉酸甲酯(MeJA)对于金钗石斛组培苗次生代谢产物合成的诱导作用。具体内容有：采用组织培养技术获得了金钗石斛组培幼苗,分别制作了不含有信号分子物质、以及含有5μmol/L SA,6mg/L硝普钠(SNP,作为NO供体)和5μmol/LMeJA的B5培养基,将长度均一的金钗石斛组培幼苗接入,放入植物组织培养室,每隔一定时间测定其中可溶性粗多糖,石斛碱和β-胡萝卜素含量,结果发现,在28天的周期内,金钗石斛组培苗多糖含量没有显著提高,均为12%,信号分子的添加并没有对多糖的含量产生影响。采用气相色谱法测定了金钗石斛组培苗中石斛碱的含量,发现随着培养时间的延长,石斛碱逐渐积累,含量由0.048mg/g增加到0.171 mg/g,28天达到最高峰。和同时间对照相比,培养基中添加了5μmol/L SA、6mg/L SNP和5μmol/L MeJA的金钗石斛组培苗中石斛碱的含量均有所增加,第28天分别比对照提高了3.2%,2.7%和5.1%,MeJA对石斛碱的诱导作用最佳,SA和SNP作用相仿,这与前人研究的三种信号分子对于其他植物次生代谢产物的诱导实验结果也类似。采用高效液相色谱法测定了金钗石斛组培苗中β-胡萝卜素含量,结果表明,与石斛碱类似,β-胡萝卜素含量也随着时间的延长而不断积累,28天达到最大值,与对照相比,MeJA使β-胡萝卜素含量提高了21.1%,SA和SNP分别为11.9%,3.9%,可见无论是石斛碱还是β-胡萝卜素,MeJA的诱导效果都是最好的。该结果与近年来国内外对于MeJA在促进植物次生代谢产物中具有显著作用的报道相一致。为了从分子水平上阐明诱导物对次生代谢产物的诱导机理,我们首次构建了金钗石斛cDNA文库,并从该文库中筛选了包括糖类代谢、生物碱代谢和色素代谢过程中的关键基因,如托品酮还原酶基因(DnTR)等作为探讨诱导物的分子机理的候选基因。通过设计基因特异引物,采用实时荧光定量PCR技术,检测了24h内1%水杨酸溶液,100μmol/L硝普钠溶液和100μmol/L茉莉酸甲酯溶液处理对金钗石斛组培苗中基因表达的影响。结果表明,三种信号分子处理对八氢番茄红素合酶基因(carRP)的表达产生较为显著的差异,与对照相比,1%水杨酸溶液处理使该基因8 h表达量达到最大,约为对照的12.2倍,100μmol/L硝普钠溶液处理使该基因在16 h表达量达到最大,约为对照的4.4倍,100μmol/L茉莉酸甲酯溶液处理使该基因在24 h表达量达到最大,约为对照的4.2倍,carRP是β-胡萝卜素合成中的关键酶基因,这与我们测定的三种信号分子处理促进金钗石斛组培苗中β-胡萝卜素积累的实验结果相一致。1%水杨酸处理对DnTRI的表达量产生显著影响,8 h达到了对照的7.21倍,100μmol/L茉莉酸甲酯溶液处理对DnTRⅡ的表达产生显著影响,24 h达到对照的6.68倍,DnTRⅠ和DnTRⅡ是生物碱合成过程中的关键酶基因,它们表达量的增加将有力的促进生物碱的合成和积累,这与我们前面所测定的三种信号分子处理有利于组培金钗石斛中石斛碱积累的结果相吻合,并且水杨酸和茉莉酸甲酯的作用效果更佳。本研究首次通过对组培苗培养基中添加MeJA、SA和NO等诱导物,采用液相和气相色谱法检测MeJA等诱导物对次生代谢物含量的影响,阐明了MeJA等信号分子对石斛碱的合成具有重要作用。通过荧光定量PCR技术对石斛次生代谢物关键基因的表达分析,发现SA和MeJA可以促进DnTR的表达,继而推测SA和MeJA对石斛碱含量的促进作用是通过促进DnTR的表达完成的。